Wrightova škvrna, materiály, technika a použitie



Škvrna Wrigtha je farebná technika vytvorená americkým patológom Jamesom Homerom Wrightom v roku 1902, zo škvrny Romanowského. Keďže Romanowskyho farbivo bolo nestabilné, Wrigth zapracoval metanol ako rozpúšťadlo a fixačnú látku.

Toto sfarbenie je polychromatické, čo znamená, že vytvára niekoľko farieb v závislosti od štruktúry, ktorú farbivo absorbuje. Táto technika farbenia bola široko používaná na vykonávanie diferenciálneho počtu bielych krviniek a štúdium morfológie červených krviniek, krvných doštičiek a leukocytov v periférnej krvi a kostnej dreni..

Jeho aplikácia je veľmi dôležitá, pretože abnormality možno pozorovať v rôznych bunkových líniách krvi, čo uľahčuje diagnostiku ochorení, ako sú leukémia alebo bakteriálne alebo parazitárne infekcie..

Možno sú to najbežnejšie aplikácie, v ktorých sa táto technika používa, ale nie sú jediné. Je tiež užitočný vo vzorkách iných ako krv a kostná dreň, ako napríklad vzorky nosného výtoku, fekálneho hlienu, spúta, kože, okrem iného..

index

  • 1 Založenie škvrny Wrightovej
  • 2 Materiály
    • 2.1 Príprava
    • 2.2 Pufrovaný tlmivý roztok
    • 2.3 Dodatočné materiály potrebné na vykonanie farbenia
  • 3 Komponenty Wrightovej škvrny
    • 3.1 Metanol
    • 3.2 Tlmič nárazov
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Metylénová modrá
  • 4 Technika
  • 5 Pomôcka
    • 5.1 Hematológia
    • 5.2 Nosová sekrécia
    • 5.3 Parazitológia
    • 5.4 Respiračná infekcia
    • 5.5 Bakteriológia
    • 5.6 Mykológia
  • 6 Ako sa pozorujú štruktúry vzorky krvi s Wrightovou škvrnou??
  • 7 Odporúčania pre dobré farbenie
  • 8 Bežné chyby pri farbení Wrigth
    • 8.1 Veľmi bledé sfarbenie
    • 8.2 Precipitáty farbiva
    • 8.3 Rozmazanie s extrémne červenkastým alebo modrým sfarbením
  • 9 Režim skladovania
  • 10 Referencie

Wrightova škvrna

Wrightova škvrna sa zrodila zo škvrny Romanowského, ktorá sa skladá z roztoku metylalkoholu z kyslého farbiva (eozín Y) a zásaditého (metylénová modrá) a jeho oxidačných produktov.

Zmes farbív používaných vo Wrightovej škvrne spôsobuje účinok známy ako Romanowsky, to znamená, že poskytuje krásne fialové sfarbenie jadier leukocytov a neutrofilných granúl, zatiaľ čo červené krvinky sú farbené do ružova..

Komponenty zodpovedné za poskytnutie farebného rozsahu, typického pre Wrightovu škvrnu, sú modré B a eozín Y. Pozorovaný účinok bude závisieť od viazania farbív na chemické štruktúry a interakcie modrej B a eozínu Y.

Kyslé štruktúry, ako sú nukleové kyseliny, jadrové proteíny a reaktívne nezrelé cytoplazmy niektorých typov buniek, fixná modrá B (základné farbivo).

Zatiaľ čo základné štruktúry, ako je hemoglobín, granule segmentovaných eozinofilov, medzi inými bunkovými štruktúrami, fixujú eozín Y (kyslé farbivo).

Výsledok zafarbenia môže byť ovplyvnený rôznymi faktormi, ako napríklad pH Wrightovho farbiva, pufrom a premývacím roztokom; ako aj čas farbenia a fixácie.

Preto je každý krok pri príprave činidiel rozhodujúci a musí sa vykonávať s ohľadom na každý detail.

materiály

Wright farbenie. Na 100 ml sa vyžaduje:

Navážte 0,3 g Wrightovho farbiva, zmerajte 97 ml metanolu a 3 ml glycerolu.

príprava

V mažiari položte veľké množstvo Wrightovho farbiva a pomaly pridávajte glycerol, kým sa prášok úplne nerozpustí..

Potom sa pridá metanol, mieša sa a naleje sa do jantárovej fľaše.

Pred použitím sa má roztok jemne pretrepať a filtrovať.

Tlmivý pufer

V litri destilovanej vody sa získalo 3,76 g hydrogenfosforečnanu sodného (Na2HPO4   2H20) plus 2,1 g dihydrogenfosforečnanu draselného (KH)2PO4).

Veľmi dobre premiešajte, kým sa všetky inkorporované činidlá nerozpustia. Upravte pH na 7,2. Nalejte do sklenenej nádoby a uchovávajte pri izbovej teplote.

Dodatočné materiály potrebné na vykonanie farbenia

Okrem toho sa na vykonávanie tejto techniky farbenia vyžadujú iné materiály, ktorými sú: fólie na prenášanie predmetov alebo obaly, most sfarbenia, pisety s vodou alebo tlmivý roztok na umývanie, stopky, aby sa brali časy farbenia a niektoré sušiace materiály (absorpčný papier, gáza alebo bavlna).

Wright škvrny komponenty

metanol

Alkohol (metanol) slúži na fixáciu krvného náteru na sklíčko.

V podstate ide o redukčné činidlo, dehydratátor a koagulačné fixačné činidlo. Jeho funkciou je preto koagulácia proteínov a ich nerozpustnosť, ale bez ich denaturácie.

Metanol je najrozšírenejším činidlom na fixáciu škvŕn vo všetkých laboratóriách, pretože poskytuje lepšie výsledky ako v prípade etanolu. Ideálna koncentrácia je 99%.

Tlmič nárazov

Tlmivý roztok (pufrovaný roztok) má funkciu nastavenia alebo udržiavania pH farbiva, pretože pH upravené na 7,2 je nevyhnutné pre bunkové štruktúry na správne absorbovanie farbív..

Na druhej strane, prechod metanolovej fixácie dehydratuje bunky a tlmivý roztok ich pomáha rehydratovať.

Eozín (Y)

Eozín má afinitu k základným zložkám, pretože je to kyslé farbivo. Dva typy eozínu sú si navzájom veľmi podobné, takže jeden z nich môže byť použitý, čím sa dosiahne rovnaký výsledok.

Jeden sa nazýva eozín Y, žltý eozín alebo tetrabromofluoresceín a ďalší eozín B, modrastý erytrozín B alebo dibromodinitrofluoresceín. Najčastejšie sa však používa eozín Y..

Najdôležitejšou vlastnosťou tohto farbiva je jeho negatívna polarita, vďaka čomu ho lákajú bunkové štruktúry s pozitívnym nábojom.

Metylénová modrá

Je to základné farbenie. Jej hlavnou vlastnosťou je metachrómia, to znamená, že nie všetky štruktúry budú farbené v rovnakej farbe, záleží na chemickom zložení štruktúr, ktoré sfarbujú..

Niektoré budú svetlé alebo tmavo modré a iné tmavo fialové alebo svetlé lila.

technika

1-Rozmetanie vzorky vykonajte tak, aby zostal tenký film na sklíčku alebo krycom sklíčku.

2-Nechajte vzduch vyschnúť asi 2 hodiny.

3-Suchý náter položte na farbiaci mostík alebo farbiacu misku so vzorkou roztiahnutou smerom nahor.

4-List zakryte farbivom Wright po kvapkách, kým nezakryje celý povrch. Nechajte pôsobiť 5 - 8 minút.

5-Farbivo by malo úplne zakryť sklíčko bez rozliatia na hrany. Ak sa počas času farbenia začne odparovať, mali by byť umiestnené ďalšie kvapky.

6-Následne pridajte rovnaké množstvo tlmiča, trochu vyfúknite, až kým sa neobjaví charakteristický kovový lesk. Trvať 10 až 15 minút.

7-Umyte vodou z vodovodu, umiestnite mäkký prúd, až kým list nevyzerá ružovo.

8 - S gázou impregnovanou alkoholom odstráňte farbivo pripojené na zadnej strane sklíčka.

9 - Pred nanesením ponorného oleja do mikroskopu nechajte škvrnu veľmi dobre vyschnúť.

užitočnosť

hematológie

Je ideálny na rozmazávanie periférnych krvných náterov, na vyšetrenie hrubých krvných náterov a na štúdium buniek zo vzoriek kostnej drene.

Kvôli chemickým vlastnostiam tejto kombinácie farbív je možné bunkové štruktúry ľahko rozpoznať, pričom sú schopné rozlíšiť rôzne typy prítomných buniek..

Nosová sekrécia

Táto technika je veľmi užitočná na identifikáciu buniek nazálnej sekrécie (epitelových buniek, segmentovaných eozinofilov, polymorfonukleárnych buniek) pri diagnostike alergickej rinitídy.

parazitológia

V tomto zmysle bolo užitočné pre štúdium Leishmania sp v histiocytoch subkutánneho bunkového tkaniva v kožných vredoch. Podobne sa používa na identifikáciu leukocytov vo vzorkách stolice (fekálny leukogram)..

V tomto prípade je zaujímavé, aby lekár vedel, či je leukocytóza prítomná vo výkaloch polymorfonukleárna alebo mononukleárna. Tento nález vo fekálnom leukograme povedie, či ide o bakteriálnu alebo vírusovú infekciu.

Na druhej strane parazity, ktoré cirkulujú v krvi, sa môžu nachádzať v erytrocyte alebo v plazme. Chceli paraziti Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii a filarií a vo veterinárnej medicíne je užitočná pri hľadaní Theileria equi a Babesia caballi, pôvodcov dojčiat, najmä u koní.

Farbenie Wright a Giemsa môže diferencovať hemoparazity od normálnych bunkových zložiek. Na tento účel môžete použiť dva typy rozšírení:

Jemné úseky

Krv sa rozotiera ako tenký film na podložke. Zafarbená Wrightovou škvrnou, ktorá odhalila vlastnosti jadra a cytoplazmy.

Silná kvapka

Táto metodika sa používa na vyšetrenie prítomnosti parazitov vo väčšom množstve krvi.

Na to sa na sklíčko umiestni veľká kvapka krvi. Akonáhle tam budete, mali by ste defibrinovať, robiť väčšie a väčšie kruhy od stredu smerom von pomocou okraja ďalšieho sklíčka.

Nakoniec, aby sa pozorovali parazity v hrubom šmu, musia byť erytrocyty lyzované vodou.

Respiračné infekcie

Na úrovni dýchania je táto technika tiež užitočná, pretože bunky prítomné vo vzorkách spúta, bronchiálna alebo bronchoalveolárna laváž sú dôležité na stanovenie diagnózy.

Podobne sa tu dajú rozlíšiť polymorfonukleárne bunky a mononukleárne bunky.

bakteriológie

Použitie tejto techniky v bakteriológii je obmedzené, pretože nie je dobré na farbenie baktérií, preto sa na farbenie používajú iné špecializované farbiace techniky..

Používa sa však na vyhľadávanie epitelových buniek s inklúznymi telieskami Chlamydia trachomatis sliznice uretry alebo endocervikálnej sliznice, aj keď sa musí uznať, že to nie je najlepšia metóda pre túto \ t.

Taktiež je možné pozorovať medzi červenými krvinkami baktérie špirálovitého typu Borrelia burgdorferi u infikovaných pacientov, ako aj morulae alebo inklúznych teliesok Ehrlichia sp v cytoplazme lymfocytov, monocytov alebo neutrofilov v krvnom nátere.

mykológia

Histoplasma capsulatum je patogénny huba často diagnostikovaný mikroskopickým pozorovaním niekoľkých vzoriek tkaniva, farbené Wrightovo farbivom.

Ako sa pozorujú štruktúry vzorky krvi s Wrightovou škvrnou?

Odporúčania pre dobré farbenie

Predĺženie vzoriek krvi by malo byť spontánne vysušené na vzduchu. Škvrny by mali byť čo najtenšie, aby sa dosiahla lepšia fixácia farbiva a zabránilo sa prekrývaniu.

Pre vysoko kvalitné farbenie sa odporúča uskutočniť farbenie počas dvoch hodín po príprave šmuhy. Na druhej strane ideálnou vzorkou je kapilárna krv bez antikoagulantu.

Avšak, v prípade, žilovej krv sa používa by mali byť použité ako antikoagulačnej EDTA a heparín nie, pretože ten môže deformovať bunkových štruktúr.

Aby sa zabránilo poškodeniu pripraveného farbiva, mali by ste ho skladovať na suchom mieste.

Počas procesu prania sa odporúča použitie vody upravenej na neutrálne pH.

Nakoniec sa odporúča testovať farbiace metódy používané v laboratóriu tak často.

To sa vykonáva farbením vzorky alebo rozšírené vzory, ako kontrola kvality. Tento krok je dôležitý, pretože zaisťuje, že farbenie je riadne pripravená a doba farbenie sú dobre štandardizované.

Ak je vzorový vzor zle zafarbený, potom existujú problémy, ktoré sa musia vyriešiť.

Bežné chyby pri farbení Wrigth

Veľmi bledé sfarbenie

Veľmi bledé šmuhy, zvyčajne kvôli veľmi krátkemu času farbenia alebo veľmi prehnanému umývaniu. Opravuje sa predĺžením doby kontaktu s farbivom alebo znížením času prania.

Farbivo sa vyzráža

Zrážanie farbivo ster môže mať viac príčin, ale najčastejšie príčiny sú: použitie farbivá nefiltrovaného farbiva na mostoch farbenie nerovnomerný, pomocou špinavé listov s prachom alebo tukom, robiť dobrú umyť úprava farbenie.

Rozmazajte s extrémne červenkastým alebo modrým sfarbením

Pufr je zodpovedný za pH farbiva. Farby s pH nižším ako je uvedené (kyselina) budú mať za následok veľmi červené škvrny.

Ak je pH farbiva nad (alkalické), získa sa extrémne namodralý náter.

Režim skladovania

Činidlo by sa malo skladovať pri izbovej teplote.

referencie

  1. V. Gutierrez Porovnávacia štúdia medzi metódou Wright farbenia a test ELISA pre diagnostiku psie Ehrlichióza v meste San Pedro Sula, Honduras. 2008. Práca na titul veterinára. Universidad de San Carlos de Guatemala.
  2. Lopez-Jaco L, Hernandez-Durán M, C-Colina Castro, Pena-Ortega S, G Ceron-González, F. Franco-Cendejas Základné farbivá v mikrobiologickom laboratóriu. Výskum zdravotného postihnutia. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Wrightova škvrna." Wikipédia, slobodná encyklopédia. 18. máj 2018, 12:05 UTC. 8 dec. 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekvencia Babesia spp. u koní montería, Córdoba (Kolumbia). Udcaactual divulgcient.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentína. Panamericana S.A Editorial.
  6. Retamales E, Mazo V. Úrad verejného zdravotníctva Čile. Odporúčania na farbenie krvných náterov na čítanie krvného obrazu.