Gram farebné základy, materiály, technika a použitie



Gramovo farbenie je najjednoduchšia a najužitočnejšia technika farbenia v diagnostickej mikrobiológii. Túto techniku ​​vytvoril dánsky lekár Hans Christian Gram v roku 1884, ktorý dokázal klasifikovať baktérie v grampozitívnych a gramnegatívnych, podľa zloženia bunkovej steny..

Táto technika prešla určitými úpravami od Huckera v roku 1921, aby sa stabilizovali činidlá a zlepšila kvalita škvŕn, takže Gramovo farbenie je tiež známe ako Gram-Hucker..

S touto technikou je tiež možné pozorovať formu, ktorú majú mikroorganizmy, to znamená, či sú to koky, bacily, kokobacily, pleomorfné, vláknité, okrem iného. Rovnako ako jeho rozloženie v priestore: v klastri, v reťazci, izolované, vo dvojiciach, v tetradoch atď..

Keď je podozrenie na bakteriálnu infekciu, väčšina prijatých vzoriek by sa mala rozotrieť na sklíčko a farbiť Gramom na vyšetrenie pod mikroskopom..

Správa Gram bude viesť lekára o tom, aký typ mikroorganizmu môže byť príčinou infekcie, pred získaním konečného výsledku plodiny..

V niektorých prípadoch je život pacienta veľmi ohrozený, takže lekári naliehavo potrebujú Gramovu správu na vykonanie empirickej liečby pri čakaní na identifikáciu mikroorganizmu.

Napríklad v prípade, že Gram tam odhaľuje Gram pozitívne koky v CSF, lekár viesť počiatočné antibiotickou liečbou na odstránenie týchto typov baktérií, podľa protokolov stanovených pre tento.

Keď konečný výsledok príde s názvom izolovaného mikroorganizmu a jeho príslušného antibiogramu, lekár zhodnotí, či má alebo nemá zmeniť liečbu. Toto rozhodnutie sa uskutoční na základe štúdie citlivosti mikroorganizmu na antibiotiká, ktoré dostáva a vývoj pacienta..

index

  • 1 Nadácia
  • 2 Materiály
  • 3 Príprava farbív a činidiel
    • 3.1. Kryštálovo fialový roztok
    • 3.2 Iodo-Lugol
    • 3.3 Bielenie
    • 3.4 Kontrast
  • 4 Skladovanie reagencií
  • 5 Príprava nátierky vzorky určenej na farbenie
    • 5.1 -Gram priamych vzoriek
    • 5.2 -Rast plodín
  • 6 Technika
  • 7 Pomôcka
  • 8 Bežné chyby
  • 9 Referencie

nadácie

Ide o techniku, ktorá predstavuje 4 základné kroky: farbenie, fixáciu mordantom, sfarbenie a protirečenie. Preto sa táto technika okrem farbenia baktérií tiež odlišuje.

Kryštálová violeť je prvým použitým farbivom. To má afinitu k peptidoglykánu a škvrna fialovej všetkých baktérií potom jódovou tinktúrou podľa, ako moridlo, ktorá je umiestnená, bude indukovať tvorbu nerozpustných komplexov kryštalickej fialovej-jód - ribonukleární proteínov v bunke.

Gram-pozitívne baktérie, ktoré majú hrubú stenu peptidoglykánu, tvoria viac komplexov (kryštálovo fialový-jód), preto si zachovávajú farbivo..

Ovplyvňuje tiež to, že stena Gram-pozitívnych baktérií obsahuje väčšie množstvo nenasýtených kyselín, ktoré vykazujú vysokú afinitu k oxidačným činidlám (Lugol)..

Medzitým majú gramnegatívne baktérie tenkú vrstvu peptidoglykánu, ktorá robí baktérie menej komplexnými ako grampozitívne baktérie..

Potom prichádza krok odfarbenia, kde sa Gram pozitívne a gramnegatívne baktérie správajú inak.

Gram-negatívne baktérie obsahujú vonkajšiu membránu bohatú na lipopolysacharidy, ktorá je súčasťou jej bunkovej steny. Tuky sú zničené kontaktom s alkoholovým acetónom, takže vonkajšia membrána je destabilizovaná, fialový kryštál je uvoľňovaný.

Toto je spôsob, ako je potom kontrastne zafarbený safranínom alebo základným fuchsinom, pričom farba je červená.

V prípade grampozitívnych baktérií odolávajú odfarbeniu, pretože bielidlo pôsobí na uzavretie pórov, čo zabraňuje úniku kryštálovo fialovej / jódovej komplexu.

Preto je sfarbenie fialovými kryštálmi stabilné a nie je tu žiadny priestor pre safranín alebo fuchsín. Z tohto dôvodu tieto baktérie zafarbia intenzívne modré alebo fialové.

materiály

Farebná súprava Gram pozostáva z:

  • Fialový kryštál
  • Lugolov
  • Acetónalkohol
  • Safranín alebo bázický fuchsín

Príprava farbív a činidiel

Roztok kryštálovo fialovej

Riešenie A:

Fialový kryštál -2 gr

Etylalkohol 95% -20cc

Riešenie B:

Oxalát amónny -0,8 g

Destilovaná voda - 80 cm3

Na konečnú prípravu fialového kryštálu sa musí roztok 1:10 zriediť destilovanou vodou a zmiešať so 4 dielmi roztoku B. Zmes sa pred použitím skladuje 24 hodín. Filtruje sa v banke na farbenie jantáru s použitím papierového filtra.

Množstvo, ktoré sa použije denne, sa prenesie do jantárovej fľaše s kvapkadlom.

Jód-Lugolov

Navážte a odmerajte uvedené množstvo každej zlúčeniny nasledovne: \ t

Kryštály Iodo-1gr

Jodid draselný - 2gr

Destilovaná voda -300 cm3

Jodid draselný sa pomaly rozpúšťa vo vode a potom sa pridá jód. Roztok sa oholí na jantárovo sfarbenú fľašu.

Množstvo, ktoré sa použije denne, sa prenesie do menšej jantárovej fľaše s kvapkadlom.

bielenie

95% etylalkohol -50 ml

Acetón - 50 ml

Pripravuje sa v rovnakých dieloch. Kryt dobre, má tendenciu sa odparovať.

Miesto vo fľaši s kvapkadlom.

Tento prípravok zaisťuje zmenu farby v miernom čase 5-10 sekúnd a je najviac odporúčaný.

Začiatočníci dávajú prednosť iba 95% etylalkoholu, kde zmena farby je pomalšia od 10 do 30 sekúnd.

Kým najskúsenejší môže byť čistý acetón, kde sa odfarbenie vyskytuje veľmi rýchlo od 1 do 5 sekúnd.

kontrastovať

Zásobný roztok safranínu

Safranina -2,5 gr

Etylalkohol 95% -100 cm3

Po zvážení uvedeného množstva sa safranín rozpustí v 100 ml etylalkoholu na 95%..

Pracovný roztok safranínu sa pripraví zo zásobného roztoku.

Na tento účel odmerajte 10 cm3 zásobného roztoku, pridajte 90 ml destilovanej vody na 100 ml.

Odporúča sa previesť množstvo, ktoré sa použije denne, na jantárovú fľašu s kvapkadlom.

Mikroorganizmy, ktoré sa sfarbia slabo gramnegatívne s Gram-Huckerovým farbivom, ako sú určité anaeróby, Legionella sp, Campylobacter sp a Brucella sp, môžu byť oveľa lepšie zafarbené, ak sa použije modifikácia, ktorú urobil Kopeloff na farbenie Gram-Huckerom, nazývané Gram-Kopeloffovo farbenie..

Táto technika mení safranínové farbivo na bázický fuchsín. Pomocou tejto modifikácie je možné účinne zafarbiť uvedené mikroorganizmy.

Skladovanie reagencií

Pripravené farbivá by sa mali skladovať pri izbovej teplote.

Príprava vzorky nanesenej na farbu

Vzorka musí obsahovať najmenej 10%. \ T5 mikroorganizmy pred pozorovaním mikroorganizmu v šmu je pravdepodobné. Nátierky môžu byť vyrobené z priamej vzorky alebo kultúr v tuhom alebo kvapalnom médiu.

Nátierky by mali byť rovnomerné, dobre rozložené a nie príliš hrubé, aby sa lepšie vizualizovali prítomné štruktúry.

-Gram priamych vzoriek

Moč na gram bez odstredivky

Mieša sa a 10 μl sa umiestni na sklíčko. Pozorovanie aspoň jedného poľa baktérie / imerzie indikuje, že ide o infekciu.

To znamená, že kultúra bude mať približne viac ako 100 000 CFU / ml (10)5 CFU / ml) v 85% prípadov.

Táto metóda nie je užitočná pre počty kolónií pod 100 000 CFU.

LCR Gram

CSF by mal byť odstredený, supernatant bol odstránený a peleta bola nanesená na sklíčko. Táto kvapalina je sterilná za normálnych podmienok; pozorovanie baktérií indikuje infekciu.

Gram respiračných vzoriek

V diagnóze bude vždy vedená spúta Gram, bronchiálna alebo bronchoalveolárna laváž, aj keď môže byť množstvo mikroorganizmov, okrem toho, že je užitočný typ pozorovaných buniek..

V prípade spúta by mal byť náter pripravený s najviac hnisavými časťami vzorky.

Stolička Gram

Neodporúča sa vykonávať Gram na tento typ vzoriek, pretože nemá žiadnu diagnostickú hodnotu.

-Gramové plodiny

Môžu byť vykonané dvomi spôsobmi, jeden z tekutých plodín a druhý z pevných plodín.

Kvapalné plodiny

Z tekutých kultúr je mimoriadne jednoduchá; pod zapaľovačom sa odoberá niekoľko pečienok zakaleného bujónu, ktoré sa umiestnia na čistý a suchý sklíčko, pričom sa kruhové pohyby pohybujú od stredu smerom k okraju, aby sa materiál rovnomerne rozložil.

Nechá sa spontánne vysušiť vo vzduchu. Po vysušení je materiál pripevnený k plechu teplom. Za týmto účelom sa pomocou svorky list 3 prechádza 4-krát plameňom horáka Bunsen, pričom dbajte na to, aby sa materiál nespálil..

List sa nechá vychladnúť a umiestni sa na farebný mostík.

Tuhé plodiny

Na uskutočnenie rozšírenia pre Gramovo farbenie z pevnej kultúry postupujte nasledovne:

Pred výberom kolónií, ktoré sa majú odobrať, sa má pripraviť sklíčko, pričom sa priblížia dve kvapky približne sterilného fyziologického roztoku.

Ak pôvodná kultivačná platňa obsahuje niekoľko rôznych typov kolónií, na uskutočnenie Gramu sa vyberie izolovaná kolónia každej z nich. Každá kolónia sa odoberie platinovou slučkou, aby sa rozpustila vo fyziologickom roztoku predtým umiestnenom na sklíčko.

Kruhové pohyby sú dané od stredu k okraju, aby sa kolónia homogénne rozložila na sklíčko..

Nechá sa spontánne vysušiť vo vzduchu. Po vysušení je list fixovaný teplom, ako je vysvetlené vyššie (horenie šmýkadla zapaľovačom), pričom dávajte pozor, aby sa materiál nespálil.

Tento postup sa musí vykonať s každým iným typom kolónie. Na kus papiera by sa malo uviesť poradie pozorovania, napríklad:

Kolónia 1: Žltá beta-hemolytická kolónia: V klastroch sa pozorovali grampozitívne koky

Kolónia 2: Krémové kolónie, bez hemolýzy: Pozorovali sa gramnegatívne kokobacily.

Každý list musí byť označený, aby vedel, čo pozorujeme.

technika

Technika farbenia podľa Grama je veľmi jednoduchá a relatívne nenákladná a nemôže byť vynechaná v mikrobiologickom laboratóriu.

To isté sa robí takto:

  1. Opravte škvrnu teplom a umiestnite na farebný most.
  2. List je po dobu 1 minúty úplne zakrytý fialovým sklom.
  3. Umyte vodou. Nesušte
  4. Platňa sa prikryje roztokom Lugol, nechá sa 1 minútu. Umyte vodou. Nesušte.
  5. Zmes sa mieša počas 5-10 sekúnd s jemným miešaním v acetónovom alkohole. Alebo umiestnite hárok do vzpriamenej polohy a kvapky kvapiek odfarbovacieho prostriedku na povrch, až kým sa neodstráni zvyšné fialové sklo. Neprekračujte.
  6. Umyte vodou. Nesušte.
  7. Nahraďte hárok na farebnom mostíku a prikryte 30 sekúnd safranínom (Gram-Hucker) alebo 1 min základným fuchsinom (Gram-Kopeloff)..
  8. Umyte vodou
  9. Nechajte spontánne vyschnúť vo zvislom vzduchu.

Po vysušení umiestnite 1 kvapku imerzného oleja na pozorovanie pod objektívom 100X v optickom mikroskope.

užitočnosť

Táto technika umožňuje rozlíšiť morfotypeintiálne rozdiely väčšiny baktérií.

Kvasinky sa tiež vyznačujú touto farbou. Vezmú krištáľovo fialovú, to znamená, že škvrny Gram pozitívne.

Na druhej strane je možné rozlišovať grampozitívne bacily tvoriace spóry, v ktorých je pozorovaný voľný priestor vo vnútri bacilu, kde sa vytvoril endospór, hoci spóry sa dobre nefarbia. Na použitie spór sa používajú iné techniky, ako napríklad Shaeffer-Fulton.

Je potrebné poznamenať, že táto škvrna neslúži na farbenie všetkých druhov baktérií, to znamená, že v prípadoch, keď farbenie nefunguje.

V tomto prípade možno uviesť baktérie, ktoré nemajú bunkovú stenu. Napríklad: rod Mycoplasma, sferoplasty, Ureaplasma, L-formy a protoplasty.

To tiež škvrny zle baktérie so stenami bohatými na kyseliny mykolové, ako sú mykobaktérie a intracelulárne baktérie, ako sú Chlamydias a Rickettsias.

Je tiež neefektívne farbiť väčšinu spirochetálnych baktérií.

Existujú baktérie rovnakého rodu, ktoré možno pozorovať v tej istej vzorke ako grampozitívne a ako gramnegatívne. Keď sa to stane, nazýva sa variabilné farbenie podľa Grama, ktoré môže byť spôsobené zmenou živín, teplotou, pH alebo koncentráciou elektrolytov..

Bežné chyby

Nadmerne sa bieli

Preháňanie v kroku sfarbenia môže spôsobiť pozorovanie falošne gramnegatívnych mikroorganizmov.

Na pridanie ponorného oleja nečakajte dostatok času na schnutie:

Táto chyba spôsobuje tvorbu mastných miciel, ktoré sťažujú pozorovanie prítomných štruktúr. Toto sa stane, keď sa olej spojí s molekulami vody prítomnými v nátere.

Reverzujte poradie činidiel:

Chyba, ako je táto, spôsobí, že gramnegatívne baktérie zobrazia fialovú, to znamená falošnú grampozitívnu.

Používajte staré plodiny (tuhé alebo kvapalné):

To môže spôsobiť Gram pozitívne baktérie farbiť Gram negatívne (falošne Gram negatívne). Deje sa to preto, že v starých kultúrach je pravdepodobné, že sú mŕtve alebo poškodené baktérie a za týchto podmienok baktérie nezachovávajú fialový kryštál..

Použite veľmi starý roztok Lugol:

Postupom času stráca lugol svoje vlastnosti a jeho farba mizne. Ak sa použije už degenerované činidlo, nebude kryštálová fialová jamka dobre fixovaná, preto existuje možnosť vizualizácie mikroorganizmov falošne gramnegatívnych.

Namodralé pozadie

Správne sfarbené pozadie bude červené. Modré pozadie znamená, že zmena farby bola nedostatočná.

referencie

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. mikrobiológie Medical, 6. vydanie McGraw-Hill, New York, USA
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydanie). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentína. Panamericana S.A Editorial
  4. Casas-Rincón G. 1994. Všeobecná mykológia. 2. vydanie Universidad Central de Venezuela, vydania knižnice. Venezuela, Caracas.
  5. "Gramovo farbenie" Wikipédia, slobodná encyklopédia. Okt 4 2018, 23:40 UTC. 9. december 2018, 17:11. Prevzaté z es.wikipedia.org.
  6. González M., González N. 2011. Príručka lekárskej mikrobiológie. 2. vydanie, Venezuela: Riaditeľstvo médií a publikácií Univerzity Carabobo.
  7. Lopez-Jaco L, Hernandez-Durán M, C-Colina Castro, Pena-Ortega S, G Ceron-González, F. Franco-Cendejas Základné farbivá v mikrobiologickom laboratóriu. Výskum zdravotného postihnutia. 2014; 3 (1): 10-18.