Spóry farbenie základ, techniky a použitie



farbenie spór je metodológia používaná na farbenie štruktúr rezistencie, ktoré tvoria niektoré bakteriálne rody, keď sú v nepriaznivých podmienkach; tieto štruktúry zodpovedajú spôsobu prežitia.

Existuje mnoho rodov, ktoré tvoria spóry; hlavnými však sú Bacillus a Clostridium. Tieto rody sa považujú za relevantnejšie, pretože majú patogénne druhy pre ľudí.

Každý bacil môže vyvolať spóru. V čase farbenia prípravku sa spóra nachádza vo vnútri bacilu (endospore) alebo mimo neho (exospore). Pri konvenčných technikách farbenia baktérií - ako je farbenie Gramom - spóry zostávajú bezfarebné.

V súčasnosti existuje niekoľko farebných metodík, ktoré dokážu prejsť cez hrubú štruktúru spór, aby ju mohli farbiť. Tieto metodiky sú veľmi rôznorodé; medzi nimi môžeme spomenúť Dornerovu techniku, Möellerovu škvrnu a metodológiu Shaeffer-Fulton, tiež známú ako Wirtz-Conklin..

Zo všetkých uvedených techník je metodológia Shaeffer-Fulton najpoužívanejšia v rutinných laboratóriách. Za svoje meno vďačí dvom mikrobiológom, ktorí vytvorili sfarbenie v roku 1930: Alicia Shaeffer a MacDonald Fulton. Niekedy sa však táto technika nazýva Wirtz-Conklin na počesť dvoch bakteriológov 19. storočia.

index

  • 1 Nadácia
  • 2 Techniky sfarbenia spór
    • 2.1 Dornerova technika
    • 2.2 Modifikovaná Dornerova technika
    • 2.3 Technika Shaeffera-Fultona alebo Wirtza-Conklina
    • 2.4 Möellerova technika
    • 2.5 Modifikovaná Möellerova technika bez tepla
  • 3 Použitie
    • 3.1 Príklady
  • 4 Odkazy

nadácie

Spóry sa nezafarbia bežnými farbami, pretože majú veľmi hrubú stenu. Komplexné zloženie spór zabraňuje vstupu väčšiny farbív.

Ak sa spóry študujú zvonku dovnútra, pozorujú sa nasledujúce vrstvy: po prvé, exosporium, čo je najtenšia vonkajšia vrstva tvorená glykoproteínmi..

Potom prichádza kutikula, ktorá poskytuje odolnosť voči vysokým teplotám, po ktorej nasleduje kortex zložený z peptidoglykánu. Potom je tu stena základne, ktorá chráni protoplasty.

Spóra je dehydratovaná štruktúra, ktorá obsahuje 15% kyseliny vápenatej a dipikolínovej. Preto je väčšina techník farbenia spór založená na aplikácii tepla, takže farbivo môže preniknúť do hrubej štruktúry.

Akonáhle sa spór farbí, nemôže odstrániť farbivo. V technike Shaeffer-Fulton, malachitová zelená vstupuje do vegetatívnych buniek a pri aplikácii tepla preniká do endospore a tiež do exosporov..

Pri praní vodou sa farbivo odstráni z vegetatívnej bunky. K tomu dochádza, pretože zelené malachitové farbivo je mierne zásadité, takže sa slabo viaže na vegetatívnu bunku.

Na druhej strane sa nemôže dostať zo spóry a nakoniec sa kontrastuje s bacilom so safranínom. Tento základ platí pre ostatné techniky, v ktorých sa niečo podobné deje.

Techniky sfarbenia spór

Ak chcete, aby spóry škvrny, musíte mať čistú kultúru podozrivého kmeňa, ktorý chcete študovať.

Kultúra je vystavená extrémnym teplotám počas 24 hodín, aby sa stimuloval mikroorganizmus na sporuláciu. Na tento účel sa kultúra môže umiestniť do pece pri 44 ° C alebo do chladničky (8 ° C) na 24 alebo 48 hodín.

Ak pri uvedených teplotách zostane príliš veľa času, budú pozorované iba exospory, pretože všetky endospory opustia bacilus.

Na konci času sa má niekoľko kvapiek sterilného fyziologického roztoku položiť na čisté podložné sklíčko. Potom sa odoberie malá časť plodiny a vykoná sa jemné rozotretie. 

Potom sa nechá uschnúť, je pripevnená k teplu a je zafarbená niektorými z techník, ktoré sú vysvetlené nižšie:

Dornerova technika

1. Pripravte v skúmavke koncentrovanú suspenziu sporulovaného mikroorganizmu v destilovanej vode a pridajte rovnaký objem filtrovaného fenolického fuchsínu Kinyoun..

2 Umiestnite skúmavku do kúpeľa s vriacou vodou na 5 až 10 minút.

3 - Na čistom sklíčku zmiešajte kvapku predchádzajúcej suspenzie s kvapkou 10% vodného roztoku nigrozínu, varte a prefiltrujte..

4- Roztiahnite a rýchlo osušte miernym teplom.

5- Preskúmajte s objektívom 100X (ponorenie).

Spóry sa vyfarbia na červeno a bakteriálne bunky sa javia ako takmer bezfarebné na tmavosivom pozadí.

Modifikovaná Dornerova technika

1 - Suspenzia mikroorganizmu sporuluje sa na sklíčko a fixuje na teplo.

2 - Vzorka sa prikryje pásikom filtračného papiera, ku ktorému sa pridáva kyselina fenicínová. Farbivo sa zahrieva 5 až 7 minút plameňom Bunsenovho horáka, až kým sa nevytvorí pary. Potom sa papier odstráni.

3. Prípravok umyte vodou a potom vysušte savým papierom.

4- Pokryte škvrnu tenkým filmom s obsahom 10% nigrosínu pomocou druhého sklíčka, aby ste roztiahli nigrosín alebo ihlu..

Zafarbenie urobené spórami a baktériami je rovnaké, ako je opísané v doterajšom stave techniky.

Technika Shaeffer-Fulton alebo Wirtz-Conklin

1. Vytvorte tenkú nátierku so suspenziou sporulovaného mikroorganizmu na sklíčku a upevnite ju na teplo.

2 - Sklíčko prekryte vodným roztokom 5% malachitovej zelene (na list možno položiť filtračný papier)..

3. Ohrejte plameňom horáka Bunsen, aby unikla para a odstránila plameň. Operáciu opakujte 6 až 10 minút. Ak sa počas procedúry odparí malachitovo zelený roztok, môže sa pridať viac.

4- Vyberte filtračný papier (ak bol vložený) a opláchnite vodou.

5- Sklíčko zakryte 0,5% vodným safranínom po dobu 30 sekúnd (niektoré varianty techniky používajú 0,1% vodný safranín a nechajte pôsobiť 3 minúty)..

S touto technikou sú spóry zelené a bacily sú červené.

Nevýhodou je, že endospory mladých kultúr sa dobre nezafarbia, pretože vyzerajú extrémne číre alebo bezfarebné. Aby sa tomu zabránilo, odporúča sa použiť kultúry trvajúce 48 hodín inkubácie.

Möellerova technika

1- Obal sa rozotrie chloroformom počas 2 minút.

2 - Chloroform sa zlikviduje.

3 - 5 minút zakryte 5% kyselinou chrómovou.

4- Umyte destilovanou vodou

List je pokrytý fuchsin-fenolovým kaprom a vystavený plameňu horáka Bunsen, až kým sa nevypustí výpary; potom sa z plameňa odstráni na niekoľko okamihov. Operácia sa opakuje, až kým nedosiahne 10 minút.

6 - Umyte vodou.

7. Na odfarbenie použite okyslený etanol (alkohol kyseliny chlorovodíkovej). Zostane 20 alebo 30 sekúnd.

8- Umyte destilovanou vodou.

9- Proti pôsobeniu krycej vrstvy s metylénovou modrou po dobu 5 minút.

10- Umyte destilovanou vodou.

11- Nechá sa vysušiť a vzorka sa odoberie pod mikroskopom.

Spóry vyzerajú červené a modré bacily. Je dôležité nevdychovať výpary, pretože sú toxické a z dlhodobého hľadiska môžu byť karcinogénne.

Modifikovaná Möellerova technika bez tepla

V roku 2007 Hayama a jeho spolupracovníci vytvorili modifikáciu techniky Möeller. Odstránili krok zahrievania farbiva a nahradili ho pridaním 2 kvapiek tergitidu Tergitol 7 na každých 10 ml fuchsín-fenolického karbolického roztoku. Získali sa rovnaké výsledky.

aplikácie

Sfarbenie spór poskytuje veľmi cennú a užitočnú informáciu pre identifikáciu patogénu, pretože prítomnosť toho istého, jeho tvar, umiestnenie v bacile a schopnosť deformovať vegetatívnu bunku sú údaje, ktoré môžu tento druh viesť. v rámci určitého pohlavia.

V tejto súvislosti stojí za zmienku, že spóry môžu byť okrúhle alebo oválne, môžu byť umiestnené v strede alebo aj v paracentrálnej, subterminálnej alebo terminálnej polohe..

Príklady

- Clostridium difficile tvorí oválnu spóru v koncovej polohe, ktorá deformuje bacil.

- Spóry Clostridium tertium Je oválny, nedeformuje bacil a nachádza sa na úrovni terminálu.

- Endospore Clostridium tetani je to terminál a deformuje bacil, čím vzniká vzhľad paličky.

- Spóry Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. Novy a C. septicum sú okrúhle alebo subterminálne oválne a deformujú bacil.

- Endospore Clostridium sordelli nachádza sa v strednej polohe s miernou deformáciou.

referencie

  1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Návrh zjednodušenej techniky farbenia spór baktérií bez použitia tepelne úspešnej modifikácie Moellerovej metódy. Eur J Med Res. 16 12 (8): 356-9.
  2. Prispievatelia Wikipédie. Moellerova škvrna. Wikipédia, Voľná ​​encyklopédia. 3. november 2018, 03:28 UTC. K dispozícii na adrese: en.wikipedia.org
  3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratórny manuál mikrobiologických techník. Katedra základných vied Akadémia mikrobiológie. Národný polytechnický inštitút.
  4. "Endospore." Wikipédia, slobodná encyklopédia. 25 februára 2018, 10:20 UTC. 10 január 2019, 02:42: en.wikipedia.org
  5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J a spolupracovníci. (2006). Personálne oddelenie Autonómnej oblasti Extremadura. Osobitný program Zväzok IV. Redakcia MAD. Sevilla-Španielsko, str. 211-212.
  6. Silva M, García M, Corrales J., Ponce E. (2006) Odborný laboratórny technik, Galician Health Service (SERGAS). Konkrétny objem predmetu 2. Redakcia MAD. Sevilla-Španielsko, str. 79-80.
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydanie). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
  8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentína. Panamericana S.A Editorial