Zakladanie agarovej krvi, použitie a príprava



krvný agar je to obohatené pevné médium, diferenciálne, ale nie selektívne. Používa sa na regeneráciu a rast veľkého množstva mikroorganizmov z klinických vzoriek alebo subkultúr.

Klasický krvný agar by mal byť zaradený na očkovanie väčšiny klinických vzoriek získaných v laboratóriu; okrem vzoriek stolice, kde nie je užitočná, pokiaľ nie sú pripravené s určitými úpravami.

Toto kultivačné médium sa v podstate skladá z obohateného bázového agaru a 5% krvi. Základ agaru sa môže líšiť podľa potrieb, ale hlavne sa bude skladať z peptonov, aminokyselín, vitamínov, mäsového extraktu, chloridu sodného, ​​agaru, okrem iného..

Pokiaľ ide o krv, zvyčajne sa vyžaduje kontakt s bioteriom, aby sa získala krv zo zvierat, ako sú ovce, králik alebo kôň. Toto však nie je vždy možné a niekedy sa používa ľudská krv.

Krvné agarové médium môže byť pripravené v laboratóriu alebo môže byť zakúpené pripravené pre spoločnosti, ktoré sú na to určené. Príprava tohto média je jedným z najcitlivejších, akákoľvek neopatrnosť v jeho príprave bude mať za následok kontaminovanú dávku.

Preto by sa mali prijať všetky možné opatrenia av konečnom dôsledku by sa mala vykonať kontrola kvality pri inkubácii pri teplote 37 ° C 1 na každých 100 pripravených tabliet..

index

  • 1 Nadácia
  • 2 Použitie
    • 2.1 Výber krvnej skupiny
    • 2.2 Výber typu základného agaru
    • 2.3 Použitie krvného agaru podľa základného média použitého na jeho prípravu
  • 3 Príprava
    • 3.1. Odvážte a rozpustite
    • 3.2 Sterilizovať
    • 3.3 Agregácia krvi
    • 3.4 Nalejte do Petriho misiek
  • 4 Odkazy

nadácie

Už bolo spomenuté, že krvný agar má charakter obohateného, ​​diferenciálneho a neselektívneho média. Suterén každej z týchto vlastností je vysvetlený nižšie.

Krvný agar je obohatené médium, pretože má ako hlavnú prísadu 5 -10% krvi na agarovej báze. Obe zlúčeniny obsahujú veľa živín a táto vlastnosť umožňuje, aby v ňom rástla väčšina kultivovateľných baktérií.

K tomuto rastu dochádza bez obmedzenia; Z tohto dôvodu je neselektívna. Ak sa však do tohto média pridávajú zlúčeniny, ktoré zabraňujú rastu niektorých mikroorganizmov a podporujú rast iných, stáva sa selektívnym. To je prípad, keď sa pridávajú určité typy antibiotík alebo antifungálnych látok.

Podobne je krvný agar diferenciálnym médiom, pretože umožňuje rozlíšiť 3 typy baktérií: beta-hemolytickú, alfa-hemolytickú a gama-hemolytickú..

Beta-hemolytickej sú tie, ktoré majú schopnosť lyžovať alebo zlomiť úplne červené krvinky, ktoré tvoria jasnú svätožiaru okolo kolónií, a tak produkujú hemolýzu alebo SS SS -hemólisis a mikroorganizmy sa nazývajú beta-hemolytické.

Príklady B-hemolytických baktérií sú Streptococcus pyogenes a Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolytiká sú tie, ktoré vykonávajú čiastočnú hemolýzu, kde sa hemoglobín oxiduje na methemoglobín, čím sa okolo kolónií vytvorí nazelenalé sfarbenie. Tento jav je známy ako hemolýza α alebo a-hemolýza a baktérie sú klasifikované ako a-hemolytické.

Príkladom a-hemolytických baktérií je Streptococcus pneumoniae a Streptococcus skupiny viridans.

Nakoniec sú tu baktérie nazývané gama-hemolytické alebo nehemolytické. Tieto rastú na agare bez toho, aby na ňom vznikali zmeny, čo je účinok známy ako y-hemolýza a mikroorganizmy sú y-hemolytické.

Príklad y-hemolytických baktérií: niektoré kmene Streptococcus skupiny D (Streptococcus bovis a Enterococcus faecalis).

aplikácie

Krvné agarové kultivačné médium je jedným z najčastejšie používaných v mikrobiologickom laboratóriu.

Medzi mikroorganizmy, ktoré sú schopné rásť v agarovom médiu krvi: prísne aeróbne baktérie, fakultatívne, mikroaerofilní, anaeróbne, Gram-pozitívne alebo gram-negatívne baktérie rýchlo rastú alebo pomaly rastúce.

Rastú aj niektoré baktérie, ktoré sú náročné alebo nepríjemné z hľadiska výživy, ako aj plesne a kvasinky. Podobne je užitočné subkultivovať alebo reaktivovať kmene, ktoré sú metabolicky veľmi slabé.

Voľba krvného typu a bázického agaru sa bude líšiť v závislosti od pravdepodobného mikroorganizmu, ktorý je podozrivý z regenerácie a použitia plaku (kultúra alebo antibiogram)..

Výber krvnej skupiny

Krv môže byť jahňacina, králik, kôň alebo človek.

Najodporúčanejšia je jahňacia krv, až na niektoré výnimky. Napríklad na izoláciu druhu Haemophilus, kde odporúčaná krv je kôň alebo králik, pretože krv z jahňacieho mäsa má enzýmy, ktoré inhibujú faktor V.

Najmenej odporúčaný je človek, ale je to najpoužívanejší, možno preto, že je to najjednoduchšie získať. 

Krv musí byť defibrinovaná, získaná bez akéhokoľvek typu prísady a od zdravých zvierat. Pri používaní ľudskej krvi je potrebné mať na pamäti niekoľko faktorov:

Ak krv pochádza od jedincov, ktorí utrpeli bakteriálne infekcie, budú mať špecifické protilátky. Za týchto podmienok bude pravdepodobne inhibovaný rast niektorých baktérií.

Ak sa získa z krvnej banky, obsahuje citrát a je možné, že sa v jeho prítomnosti nevyskytujú určité baktérie. Na druhej strane, ak krv prichádza od pacientov, ktorí užívajú antibiotiká, rast citlivých baktérií môže byť inhibovaný.

A ak je krv z diabetickej osoby, prebytočná glukóza narúša správny vývoj vzorov hemolýzy.

Výber typu základného agaru

Agar bázy použitá na prípravu krvnom agare môže byť veľmi široká. Medzi nimi sú: agar, z mozgu a srdca infúzne agar, Trypticase soy agar Mueller Hinton agar, Thayer Martin agar, Columbia agar, agar Brucella, Campylobacter agar, atď..

Použitie krvného agaru podľa základného média použitého na jeho prípravu

Živný agar

Táto báza je najmenej používaná, pretože na nej budú rásť najmä nenáročné baktérie, ako sú enterické bacily, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, medzi inými. Neodporúča sa izolovať Streptococcus.

Srdcový mozgový infúzny agar (BHI)

Je to jeden z najviac používaných ako základ krvného agaru, pretože má potrebné živiny na rast väčšiny baktérií, vrátane Streptococcus sp a iné náročné baktérie. Hoci nie je vhodné pozorovať vzory hemolýzy.

S touto bázou sa zvyčajne používa jahňacia krv.

Môžu sa tiež pripraviť varianty krvného agaru, kde sa pridajú iné zlúčeniny na izoláciu určitých mikroorganizmov. Na izoláciu slúži napríklad agar s infúziou mozgového srdca doplnený králičou krvou, cystínom a glukózou Francisella tularensis.

Vzhľadom na to, že s cystínom je telurit užitočný na izoláciu Corynebacterium diphteriae. Môžete použiť ľudskú alebo jahňaciu krv.

Pri prvej beta-hemolýze bude vyzerať ako úzky halo, zatiaľ čo druhý bude halo oveľa širší.

Podobne sa táto báza spolu s bacitracínom, kukuričným škrobom, konskou krvou a ďalšími obohatenými doplnkami (IsoVitaleX) používa na izoláciu rodu. Haemophilus sp z respiračných vzoriek.

Tiež, ak sa pridá kombinácia antibiotík chloramfenikolu - gentamicín alebo penicilín - streptomycín konské krvi, to je ideálny pre izoláciu patogénnych húb náročných a dokonca aj vynikajúci výkon na Sabouraud agare glukózy. Zvlášť je to užitočné v izolácii Histoplasma capsulatum.

Tryptívna sója

Táto báza je najviac odporúčaná na lepšie pozorovanie vzoru hemolýzy a na vykonávanie diagnostických testov, ako sú taxóny optoquínu a bacitracínu. Je to klasický krvný agar, ktorý sa používa rutinne.

S touto základňou môžete pripraviť aj špeciálny krvný agar Corynebacterium diphteriae, cystínom a krv jahňacieho mäsa.

Podobne je kombinácia tohto agaru s jahňacej krvi a kanamycínu-vankomycínu ideálna na rast anaeróbov, najmä Bacteroides sp.

Agar Müeller Hinton

Táto báza doplnená krvou sa používa na vykonanie antibiogramu náročných mikroorganizmov, ako napr Streptococcus sp.

Je tiež užitočná na izoláciu baktérií Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin

Toto médium je ideálne ako základ pre krvný agar, keď je podozrenie na rod Neisseria Neisseria meningitidis, ako N. gonorrhoeae nerastie na krvnom agare.

Slúži tiež na vykonanie testov citlivosti Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Táto báza je vynikajúca na očkovanie vzoriek žalúdočných biopsií pri hľadaní Helicobacter pylori.

Médium bolo pripravené pridaním 7% defibrinované ovčej krvi s antibiotikami (vankomycín, trimetoprim, amfotericín B a cefsulodin) obmedziť rast iných baktérií, ktoré môžu byť prítomné.

Táto rovnaká báza doplnená ľudskou alebo jahňacou krvou, kyselinou nalidixovou a kolistínom je užitočná na izoláciu Gardnerella vaginalis. Je tiež ideálny na hodnotenie antimikrobiálnej citlivosti na antibiotiká rovnakého mikroorganizmu.

Okrem toho sa používa na prípravu krvného agaru na kultiváciu anaeróbov, pridanie aminoglykozidov a vankomycínu..

Táto báza nám umožňuje správne pozorovať vzory hemolýzy.

Brucella Agar

Toto médium použité ako základ krvného agaru spolu s prídavkom vitamínu K je ideálne na kultiváciu anaeróbnych baktérií. V tomto prípade sa odporúča použitie jahňacej krvi.

Agaru Campylobacter

Campylobacter agaru doplnenom 5% ovčej krvi a piatich antibiotík (cefalotínu, amfotericín B, trimethoprimu, polymyxínu B a vankomycín), je médium pre izoláciu Campylobacter jejuni vo vzorkách stolice.

príprava

Každý obchodný dom prináša na zadnú stranu obalu pokyny na prípravu litra kultivačného média. Zodpovedajúce výpočty môžu byť uskutočnené na prípravu požadovaného množstva podľa zvoleného základného agaru.

Odvážte a rozpustite

Základný agar je dehydrovaný (prášok), takže sa musí rozpustiť v destilovanej vode upravenej na pH 7,3.

Množstvo indikované zvoleným základným agarom sa odváži a rozpustí v zodpovedajúcom množstve vody vo fiole, potom sa zahreje na mierne teplo a mieša sa s rotujúcimi pohybmi, až kým sa všetok prášok nerozpustí..

sterilizovať

Po rozpustení sa sterilizuje v autokláve pri teplote 121 ° C počas 20 minút.

Agregát krvi

Pri opustení autoklávu sa fiola nechá vychladnúť, až kým teplota neklesne medzi 40 až 50 ° C; je teplota, ktorú ľudská koža podporuje a zároveň agar ešte nestuhol.

Za týmto účelom sa fiola dotýka ruky a ak je teplo tolerovateľné, je ideálnou teplotou pridať zodpovedajúce množstvo defibrinovanej krvi (50 ml na liter agaru). Jemne premiešajte, aby sa homogenizovala.

Prechod agregátu krvi je rozhodujúci, pretože ak sa vykoná, keď je médium veľmi horúce, červené krvinky sa rozbijú a médium nebude slúžiť na pozorovanie hemolýzy.

Ak je pridaná príliš studená, budú sa tvoriť hrudky a povrch média nebude hladký, aby sa flétna stala správne.

Nalejte do Petriho misiek

Podávajte v sterilných Petriho miskách bezprostredne po homogenizácii krvi. Do každej Petriho misky sa naleje približne 20 ml. Tento postup sa vykonáva v digestore s laminárnym prúdením alebo v blízkosti horáka.

Pri podávaní krvného agaru v Petriho miskách by na povrchu platničky nemali zostať žiadne vzduchové bubliny. Ak sa tak stane, plameň Bunsenovho horáka sa rýchlo prenesie cez platňu, aby sa odstránil..

Doštičky sa nechajú stuhnúť a uchovávajú sa v chladničke (2 - 8 ° C) prevrátenej až do použitia. Pred použitím krvných agarových platničiek by ste mali byť temperované (nechať ich pri izbovej teplote), aby boli zasiate.

Pripravené platne trvajú približne 1 týždeň.

referencie

  1. Bayona M. Mikrobiologické podmienky pre pestovanie. \ T Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
  2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktická klinická mikrobiológia. Univerzita v Cadiz, 2. vydanie. UCA Publications Service.
  3. "Agarová krv." Wikipédia, slobodná encyklopédia. 10 Dec 2018, 14:55 UTC. 27 december 2018, 01: 49 sk.wikipedia.org.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentína. Panamericana S.A Editorial.
  5. Laboratórne veterinárne diagnostické centrum CEDIVET. Guatemala. K dispozícii na adrese: trensa.com.
  6.  Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydanie). Argentina, Editorial Panamericana S.A..