Nadácia Agar Sabouraud, príprava a použitie

Sabouraud agar, Tiež známy ako Sabouraudov agar s dextrózou, je to pevné kultivačné médium, zvlášť obohatené na izoláciu a vývoj húb, ako sú kvasinky, plesne a dermatofyty..

To znamená, že v mikrobiologickom laboratóriu to nemôže chýbať pri skúmaní prítomnosti patogénnych alebo oportúnnych húb, či už z klinických alebo neklinických vzoriek. Podobne je tiež ideálny pre rast vláknitých baktérií, ako sú Streptomyces a Nocardia. Jeho použitie je veľmi široké, môže sa použiť v humánnej, živočíšnej, rastlinnej a priemyselnej mykológii.

Toto médium vzniklo v r. 1896 renomovaným dermatológom Raimondom Sabouraudom, ktorý sa stal svetovo uznávaným špecialistom na poruchy pokožky hlavy, hlavne dermatofytmi..

Jeho vytvorenie bolo natoľko dôležité, že sa odvtedy používa a pokračuje dodnes, aj keď s určitými úpravami.

Aj keď je táto baktéria špeciálna pre huby, v tomto médiu môžu baktérie rásť, preto pri vzorkách so zmiešanou flórou je potrebné zahrnúť do ich prípravy antibiotiká a tým inhibovať rast bakteriálnej flóry, ktorá môže byť prítomná..

Voľba antibiotika by sa mala robiť s opatrnosťou as ohľadom na typ huby, ktorú chcete obnoviť, pretože niektoré sú inhibované v prítomnosti určitých látok..

index

• 1 Nadácia
  • 1.1 Najpoužívanejšie kombinácie Sabouraudovho dextrózového agaru s antibiotikami
• 2 Príprava
  • 2.1 Dextrosa Sabouraud Agar 
  • 2.2 Agar s dextrózou Sabouraud (modifikácia Emmons)
  • 2.3 Sabouraud dextrózový agar (modifikácia Emmons) chloramfenikolom
  • 2.4 Agar s dextrózou Sabouraud Emmons s cykloheximidom
  • 2.5 Dextróza Sabouraud Agar (Emmons) s chloramfenikolom a cykloheximidom
  • 2.6 Iné antibiotiká, ktoré sa môžu pridať
• 3 Osobitné úvahy
• 4 Kontrola kvality
• 5 Použitie
  • 5.1 Primárna kultivácia
  • 5.2 Sporulácia
  • 5.3 Ochrana
  • 5.4 Mikrokultúry
  • 5.5 V ľudskej mykológii
  • 5.6 Mykológia zvierat
  • 5.7 Environmentálna mykológia
  • 5.8 Priemyselná mykológia
  • 5.9 Mykológia rastlín
• 6 Referencie

nadácie

Sabouraud dextrózový agar je médium, ktoré je vo svojej pôvodnej formulácii slabo selektívne vzhľadom na kyslé pH 5,6 ± 0,2, avšak baktérie sa môžu stále vyvíjať, najmä v predĺžených inkubáciách.

Médium obsahuje kazeínový peptón a zvieracie tkanivo štiepené pankreasom, ktoré poskytujú zdroj uhlíka a dusíka na vývoj mikroorganizmov.

Obsahuje tiež vysokú koncentráciu glukózy, ktorá pôsobí ako zdroj energie, čo podporuje rast húb nad baktériami. Všetky zmiešané s agar-agarom, zložkou, ktorá poskytuje správnu konzistenciu.

Na druhej strane Sabouraudov dextrózový agar môže byť selektívny, ak sa pridajú antibiotiká.

S antibiotikami je obzvlášť užitočný vo vzorkách rán, otvorených vredoch alebo v akejkoľvek vzorke, pri ktorej je podozrenie na veľkú bakteriálnu kontamináciu.

Najpoužívanejšie kombinácie Sabouraudovho dextrózového agaru s antibiotikami

-Sabouraud agar s chloramfenikolom: ideálny na regeneráciu kvasiniek a vláknitých húb.

-Sabouraud agar s gentamicínom a chloramfenikolom: v tomto médiu rastú takmer všetky vláknité huby a kvasinky a inhibuje veľké množstvo baktérií, vrátane Enterobacteria, Pseudomonas a Staphylococcus.

-Sabouraud agar s cykloheximidom: je obzvlášť užitočný pre vzorky z kože alebo dýchacích ciest, pokiaľ je podozrenie, že ide o dimorfné huby.

Cykloheximid sa má používať opatrne; Hoci sa používa na inhibíciu rastu nepatogénnych alebo environmentálnych húb a kvasiniek, ktoré môžu byť prítomné ako kontaminanty vo vzorke, tiež inhibuje rast niektorých húb, ako sú napr. Cryptococcus neoformans,  Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp iné oportúnne huby.

-Sabouraud agar s chloramfenikolom a cykloheximidom sa používa hlavne na izoláciu dimorfných dermatofytov a húb. Má tú nevýhodu, že inhibuje niektoré druhy oportúnnych húb ako Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes alebo C. neoformans.

-Sabouraud agar s chloramfenikolom, streptomycínom, penicilínom G a cykloheximidom: je ideálny pre vzorky extrémne kontaminované baktériami a saprofytickými hubami, ale má tú nevýhodu, že inhibuje rast Actinomyces a Nocardias, okrem vyššie uvedených oportúnnych húb.

príprava

Ak máte zložky oddelene, môžete ich pripraviť nasledujúcim spôsobom:

Dextrózový agar Sabouraud 

ľutovať:

- 40 g dextrózy

- 10 g peptónu

- 15 g agaru-agaru

- Odmerajte 1000 ml destilovanej vody

Všetky zložky sa zmiešajú, pH sa upraví na 5,6. Rozpustite rozpustené látky rozpustením, rozdeľte 20 ml média v skúmavkách s rozmermi 25 x 150 mm, bez príruby a s bavlnenou špičkou, pokiaľ možno.

V závislosti od dostupnosti je možné použiť aj iné veľkosti rúr.

Autoklávujú sa 10 minút pri tlakovej atmosfére (121 ° C). Neprekračujte čas autoklávovania. Pri opúšťaní autoklávu sa skúmavky nakláňajú podperou, až kým nestuhnú v špičke drážky..

Ďalším spôsobom je rozpustenie zložiek zahrievaním, až kým sa nevyparí. V rovnakom autokláve fiola počas 10 minút a potom rozdelte 20 ml v Petriho miskách.

Ak je k dispozícii médium so Sabouraudovým dextrózovým agarom, ktoré už obsahuje všetky zložky, zvážime množstvo špecifikované komerčným domom na jeden liter vody. Zvyšné kroky sú rovnaké ako tie opísané vyššie.

Dextrózový agar Sabouraud (modifikácia Emmons)

ľutovať:

-  20 g dextrózy

- 10 g peptónu

-  17 g agaru-agaru

-  Odmerajte 1000 ml destilovanej vody

Všetky zložky sa zmiešajú, pH sa upraví na 6,9. Postupujte rovnako ako v predchádzajúcom prípade.

Existujú komerčné domy, ktoré ponúkajú médium so všetkými zložkami. V tomto prípade zvážte a pripravte tak, ako je opísané vo vložke.

Sabouraud dextrózový agar (modifikácia Emmons) chloramfenikolom

Zásobný roztok chloramfenikolu

- Navážte 500 mg bázy chloramfenikolu

- Odmerajte 100 ml 95% etanolu

- zmiešať

Médium Sabouraudovho dextrózového agaru (Emmons) sa pripraví ako je opísané vyššie a navyše pre každý liter média sa pred autoklávovaním pridá 10 ml zásobného roztoku chloramfenikolu..

Dextrózový agar Sabouraud Emmons s cykloheximidom

Zásobný roztok cykloheximidu

- Odváži sa 5 g cykloheximidu

- Odmerajte 100 ml acetónu

- zmiešať

Médium Sabouraudovho dextrózového agaru (Emmons) sa pripraví, ako už bolo opísané, a navyše pre každý liter média sa pred autoklávovaním pridá 10 ml zásobného roztoku cykloheximidu..

Sabouraud dextrózový agar (Emmons) s chloramfenikolom a cykloheximidom

Sabouraud dextrózové agarové médium (Emmons) sa pripraví tak, ako je opísané vyššie, a navyše pre každý liter média sa pridá 10 ml zásobného roztoku chloramfenikolu a 10 ml zásobného roztoku cykloheximidu pred autoklávovaním..

Iné antibiotiká, ktoré môžu byť pridané

20 000 až 60 000 jednotiek penicilínu na liter média.

30 mg streptomycínu na liter média.

Obe by mali byť zapracované po autoklávovaní média, mierne ochladené (50-55 ° C)..

0,04 g neomycínu na liter média.

0,04 g gentamycínu na liter média.

Osobitné úvahy

Z bezpečnostných dôvodov je výhodné umiestniť Sabouraudov agar dextrózy do klinovito tvarovaných rúrok (naklonených v píku na flautách) namiesto do Petriho misiek, aby sa zabránilo disperzii a inhalácii spór..

Je dôležité, aby boli skúmavky so Sabouraudovým agarom pokryté bavlnou a nie skrutkovým uzáverom, pretože sa ukázalo, že semianaeróbne podmienky inhibujú tvorbu spór v niektorých kmeňoch, napr. Coccidioides immitis. Okrem toho väčšina húb je aeróbna.

Ak používate skrutkovací uzáver, nezatvárajte pevne.

Kontrola kvality

Pripravené médiá musia mať kontrolu kvality na overenie ich správneho fungovania. Na tento účel sú zasiate určité kontrolné kmene.

Na Sabouraudov agar s dextrózovým agarom s chloramfenikol ATCC kmeňmi sa môže použiť. Candida albicans, ktoré musia mať vynikajúci rast. Iná platňa je inokulovaná kmeňmi Escherichia coli, musí byť úplne inhibovaný.

Inkubuje sa neinokulovaná platňa, v ktorej by nemal rásť žiadny mikroorganizmus.

Sabouraud dextrózový agar s chloramfenikolom a cykloheximidom sa môžu použiť kmene  Trichophyton mentagrophytes, sa musí dobre rozvíjať. Ďalšia platňa sa naočkuje kmeňom Aspergillus flavus, v ktorom musí byť malý rast alebo žiadny rast. Okrem toho sa neinokulovaná platňa inkubuje, aby sa preukázala jej sterilita.

Pre Sabouraudov dextrózový agar s cykloheximidom, kmene. \ T Candida albicans, Trichophyton rubrum  alebo Microsporum canis, vykazovať dobrý rast.

Podobne aj kmeň Aspergillus flavus, vykazujú malý rast alebo žiadny rast. Nakoniec inkubujte neinokulovanú platňu na kontrolu sterility.

aplikácie

Primárna kultivácia

Klasický dextrózový agar Sabouraud obsahuje 4 gramy dextrózy a je vynikajúci ako primárne izolačné médium, pretože vykazuje charakteristickú morfológiu každej huby.

Je tiež vynikajúce demonštrovať výrobu pigmentov. Nie je to však najvhodnejší prostriedok na pozorovanie sporulácie.

Neodporúča sa ani rast Blastomyces dermatitidis, ktorý je inhibovaný vysokou koncentráciou prítomnej glukózy.

Na druhej strane je potrebné mať na pamäti určité úvahy pre pestovanie.

Niektoré huby sa vyvíjajú lepšie pri izbovej teplote, ako napríklad plesne, iné sa úspešne vyvíjajú pri teplote 37 ° C, ako niektoré kvasinky, a iné sa môžu vyvíjať pri oboch teplotách (dimorfné huby)..

Z tohto dôvodu je niekedy nevyhnutné použiť niekoľko Sabouraudových agarových platní pre tú istú vzorku, pretože sú často zasadené v duplikáte, aby sa jedna platňa inkubovala pri teplote miestnosti a ďalšia platňa pri 37 ° C..

Napríklad, Sporothrix schenckii je zasiate do dvoch platní; jedna sa inkubuje pri teplote miestnosti, aby sa získala fáza formy, a druhá sa inkubuje pri teplote 37 ° C, aby sa získala fáza kvasinkového typu, ale v druhej fáze je potrebné pridať 5% krvi do média..

V iných prípadoch, ako vo vzorkách mycetómov, sa vysejú dve platne Sabouraudovho agaru, jeden s chloramfenikolom a druhý s cykloheximidom. Prvý umožní rast kauzálnych agens mycetómu mykotického pôvodu (Eumicetoma) a druhého pôvodcu mycetómov bakteriálneho pôvodu, ako sú aktinomycetómy..

sporuláciu

Agar dextrózy Sabouraud modifikovaný Emmons obsahuje 2 gramy dextrózy a nie je používaný len na izoláciu, ale aj na sporuláciu a ochranu húb..

V tomto médiu, ak môžete obnoviť kmene Blastomyces dermatitidis.

konzervácia

Na ochranu hubových kultúr je možné uchovávať v chladničke (2 - 8 ° C). Doba skladovania sa môže pohybovať medzi 2 až 8 týždňami. Po tomto čase musia byť subkultivovaní, aby sa proces zopakoval.

Niektoré huby sa najlepšie udržiavajú pri teplote miestnosti, ako je napr Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum a Microsporum audounii.

Udržiavanie kmeňa sa môže predĺžiť, aby sa zabránilo pleomorfizmu, ak sa dextróza úplne odstráni z agaru a ak sa množstvo agaru v médiu zníži, aby sa zabránilo suchosti..

mikrokultúry

Na identifikáciu niektorých vláknitých húb je potrebné vykonať mikrokultúry s použitím Sabouraudovho agaru alebo iných špeciálnych prostriedkov na pozorovanie štruktúr sexuálnej a asexuálnej reprodukcie..

V ľudskej mykológii

Používa sa hlavne na diagnostiku plesňových ochorení, najmä tých, ktoré ovplyvňujú pokožku a jej prílohy (vlasy a nechty)..

Vzorky môžu byť sekréty, exsudáty, koža, vlasy, nechty, spúta, CSF alebo moč. Bežne izolované patogény sú dermatofyty, huby, ktoré spôsobujú subkutánne a systémové plesňové infekcie.

Živočíšna mykológia

Zvieratá sú často postihnuté plesňovými infekciami, takže Sabouraud agar je rovnako užitočný u zvierat ako u ľudskej mykológie..

Napríklad dermatofyty často postihujú zvieratá. Taký je prípad Microsporum canis var distum, často infikuje psov, mačky, kone, ošípané a opice. tiež, Microsporum gypseum infikuje psov, mačky a dobytok.

Vtáky, ako sú kurčatá, kohúty a kurčatá, sú postihnuté Microsporum gallinae.

Ostatné huby, ako Zymonema farciminosum, sú tiež príčinou chorôb zvierat, najmä u koní, mulov a oslov, čo spôsobuje dôležitý zápal v lymfatických cievach.

Sporothrix schenkii a Histoplasma capsulatum ovplyvňujú domáce a ľudské zvieratá.

Environmentálna mykológia

Mnohé patogénne alebo oportúnne huby sa môžu v danom čase koncentrovať v danom prostredí, najmä v operačných sálech a jednotkách intenzívnej starostlivosti (ICU) kliník a nemocníc. Preto je potrebné ich kontrolovať.

Ďalšími zraniteľnými priestormi sú knižnice a staré budovy, ktoré môžu byť ovplyvnené koncentráciou environmentálnych húb.

V environmentálnych štúdiách Sabouraud dextrózový agar používa na izoláciu húb.

Priemyselná mykológia

Sabouraud dextrózový agar nemôže chýbať pri štúdiu hubových kontaminantov pri výrobe kozmetiky, potravín, nápojov, kože, textílií, okrem iného.

Rastlinná mykológia

Rastliny tiež trpia chorobami spôsobenými hubami, ktoré ovplyvňujú rôzne časti rastliny, ktoré môžu dokonca ukončiť zber, čo spôsobuje veľké straty v poľnohospodárstve.

referencie

1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiologická diagnostika mykóz a štúdie citlivosti na antimykotiká. Odporúčania španielskej spoločnosti infekčných chorôb a klinickej mikrobiológie. K dispozícii na adrese: coesant-seimc.org
2. Laboratórium ValteK. (2009). Sabouraud dextrózový agar s cykloheximidom. Dostupné na: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Veterinárna mykológia. Národná agrárna univerzita. Nikaragua.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Argentína. Panamericana S.A Editorial
5. Casas-Rincon G. Všeobecná mykológia. 1994. 2. ed. Universidad Central de Venezuela, edície knižnice. Venezuela, Caracas.