Nadácia Agar Müeller Hinton, príprava a použitie



Müeller Hinton agar Je to pevné, neselektívne živné médium, ktoré sa skladá z mäsovej infúzie, peptónu z kazeínovej kyseliny, škrobu, agaru a destilovanej vody. Toto médium umožňuje vynikajúci mikrobiálny vývoj najrýchlejšie rastúcich baktérií.

Pôvodne ho vytvorili John Howard Müeller a Jane Hinton, aby izolovali nutrične náročné baktérie, ako napr Neisseria gonorrhoeae a Neisseria meningitidis. Vzhľadom na svoje vlastnosti sa však ukázalo ako ideálne pre štúdium citlivosti na antibiotiká, ktoré poskytujú spoľahlivé a reprodukovateľné výsledky..

Z tohto dôvodu je agar Müeller Hinton kultivačným médiom prijatým Inštitútom pre klinické a laboratórne štandardy (CLSI) a Európskym výborom pre testovanie citlivosti na antimikrobiálne testy na vykonanie testu citlivosti na antimikrobiálne vlastnosti metódou Kirbyho diskovej difúzie. Bauer.

index

  • 1 Nadácia
  • 2 Príprava
  • 3 Použitie
    • 3.1 Antimikrobiálna technika
    • 3.2 Strategické umiestnenie diskov na agar Müeller Hinton
  • 4 Príčiny chybných výsledkov
  • 5 Obmedzenie
  • 6 Kontrola kvality
  • 7 Referencie

nadácie

Pretože ide o neselektívne živné médium, je výborný pre rast väčšiny patogénnych baktérií.

Na druhej strane, jeho jednoduché zloženie umožňuje, aby látky na ňom ľahko difundovali, čo je základnou charakteristikou testu citlivosti metódou diskovej difúzie..

Ďalšou z jeho vlastností je, že obsahuje malé množstvo inhibítorov, ktoré umožňujú efektívne vyhodnotenie sulfónamidov, trimetoprimu a tetracyklínov..

Treba však mať na pamäti, že médium musí spĺňať určité podmienky na zabezpečenie jeho riadneho fungovania, vrátane: \ t

Úprava pH, hĺbka agaru a adekvátna koncentrácia tymínu, tymidínu, Ca++, mg++ a Zn++.

Musíme tiež vedieť, že metodika je štandardizovaná, a preto musia byť splnené všetky parametre, ako napríklad:

Koncentrácia inokula, koncentrácia a uchovanie antibiotických diskov, umiestnenie vhodného počtu diskov na agare, vzdialenosť medzi jednotlivými diskami, strategické umiestnenie určitých antibiotík, atmosféra, teplota a čas inkubácie.

príprava

Navážte 37 g dehydratovaného média Müeller Hinton a rozpustite v 1 litri destilovanej vody. Zahrievajte médium za miešania, aby ste ho rozpustili. Nechajte variť 1 minútu.

Vezmite autokláv na sterilizáciu pri 121 ° C počas 15 minút. Pri vyberaní z autoklávu sa fiola umiestni do vodného kúpeľa s teplotou 50 ° C, aby sa ochladila. Nalejte 25 až 30 ml do sterilných Petriho misiek s priemerom 10 cm.

Platne by mali mať priemernú hrúbku 4 mm (ideálne) s povoleným rozsahom 3-5 mm.

Ak je žiaduce pripraviť krvný agar s použitím agarovej bázy Müeller Hinton, pred podávaním na platne sa naleje 5% sterilná a defibrinovaná jahňacia krv..

Konečné pH média by malo byť medzi 7,2 až 7,4.

Investujte a uchovávajte v chladničke až do použitia. Pred použitím nechajte platňu odobrať izbovú teplotu.

Farba pripraveného média je svetlo béžová.

aplikácie

Používa sa na vykonanie antibiogramu alebo testu citlivosti na antibiotiká na väčšinu rýchlorastúcich patogénov.

Ak je agar doplnený krvou, slúži na vykonanie antibiogramu náročných mikroorganizmov, ako sú: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, medzi inými. Tiež sa používa na izoláciu Legionella pneumophila.

Antibiogramová technika

Pred vykonaním antibiogramu sa musí pripraviť bakteriálny roztok ekvivalentný 1,5 x 108 bunka.

Za týmto účelom sa z čistej kultúry odoberú 3 až 4 kolónie a suspendujú sa v triptikózovom sójovom bujóne alebo v bujóne Müeller Hinton, inkubujú sa 2 až 6 hodín a koncentrácia sa upraví sterilným fyziologickým roztokom, porovnajúc ho so štandardom Mac Farland. 0,5%.

Ak požadujú mikroorganizmy, kolónie môžu byť suspendované priamo, až kým nedosiahnu koncentráciu 0,5% Mac Farlandu. Potom sa doska Müeller Hinton vyseje tampónom impregnovaným pripraveným bakteriálnym roztokom.

Na tento účel ponorte tampón do roztoku a potom prebytočnú kvapalinu odstráňte pritlačením na steny trubice. Ihneď po vytieraní tampónu po celom povrchu, nezanechávajte žiadne nedotknuté miesta, potom jemne otočte doštičku a znovu zasejte. Operácia sa opakuje ešte dvakrát.

Nechajte odstáť 10 minút a potom vložte antibiotické disky sterilnými kliešťami, pričom medzi nimi ponechajte priestor 24 mm. Po umiestnení každého disku na agar zľahka zatlačte každú z nich pomocou svorky, aby ste sa uistili, že sú dobre prilepené.

Po tomto postupe sa doštička prevráti a inkubuje pri teplote 35 až 37 ° C v aerobióze počas 16 až 18 hodín. Ak ide o náročný mikroorganizmus, môže vyžadovať mikroaerofíliu a ak antibiogram obsahuje oxacilínové disky, mal by sa čítať po 24 hodinách..

Na meranie priemeru každého halo sa používa pravítko. Výsledky sa zaznamenajú v mm. Následne sa získané hodnoty korelujú s tabuľkami rezných bodov publikovanými v aktuálnom manuáli CLSI.

V prípade potreby uveďte ako citlivý (S), medziprodukt (I) alebo rezistentný (R).

Antibiotiká sú vybrané podľa izolovaného mikroorganizmu a typu infekcie, ktorá sa vyskytuje.

Niekedy by sa malo zvážiť strategické umiestnenie antibiotík, aby sa preukázali vzory fenotypovej rezistencie.

Strategické umiestnenie diskov na agar Müeller Hinton

Pre enterobaktérie musí byť disk s kyselinou klavulanovou umiestnený pred cefalosporínmi tretej a štvrtej generácie. Rozšírenie v tvare vajec naznačuje, že kmeň je výrobcom beta-laktamáz s rozšíreným spektrom (ESBL). To znamená, že pacient sa nemá liečiť žiadnym cefalosporínom.

V prípade Staphylococcus je dôležité umiestniť erytromycín alebo azitromycínový disk pred klindamycínový disk (D-test).

Rezistentný halo v erytromycíne a sploštenie v klindamycínovom halo indikuje, že kmeň má indukovateľnú rezistenciu na klindamycín, kmeň (RIC). To znamená, že liečba klindamycínom nebude účinná.

Na vyhľadávanie indukovateľných kmeňov AMP C v Enterobacteriaceae a niektorých nefermentujúcich gramnegatívnych bacilách sú disky ceftazidímu, cefoxitínu alebo piperacilínu tazobaktánu konfrontované s imipenémovým diskom vo vzdialenosti 27 mm..

Halogén sploštený v jednom z diskov proti imipenému indikuje prítomnosť indukovateľného AMP C.

Pri hľadaní konštitutívneho AMP C je kloxacilín 500 μg disk vystavený ceftazidímu (30 μg) a cefotaxímu (30 μg) vo vzdialenosti 25 mm. Rozšírený halo v jednom z cefalosporínov indikuje pozitivitu.

Kloxacilínový disk môže byť tiež nahradený 9 mm kotúčom filtračného papiera Whatman No. 6 impregnovaného kyselinou fenylborónovou (400 μg) so vzdialenosťou 18 mm. Vykladá sa rovnako ako predchádzajúce.

Nakoniec, aby sa preskúmala produkcia metalo-beta-laktamáz, najmä v Pseudomonas aeruginosa, vo vzdialenosti 15 mm sa použije disk impregnovaný 10 μl kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA 750 μg) a kyseliny tioglykolovej (SMA 300 μg), ktorá je umiestnená na diskoch s imipenémom a meropenémom..

Test je pozitívny, ak sa rozšíri imipenem alebo meropenem halo na EDTA / SMA disk. Tento výsledok musí byť potvrdený modifikovaným Hodgeovým testom.

Táto metóda spočíva v inokulácii kmeňa Escherichia coli ATCC 25922 na doske Müeller Hinton. Imipenemový disk sa umiestni do stredu platne a potom sa z disku smerom k okraju vytvorí drážka s napätím P. aeruginosa podozrivé. Môžete testovať až 4 kmene na platňu.

Test bude pozitívny, ak je okolo strie deformačná zóna imipenemového halo.

Príčiny chybných výsledkov

-Disky so slabo konzervovanými antibiotikami môžu produkovať falošné rezistencie. Napríklad oxacilínový disk je veľmi citlivý na zmeny teploty.

-PH média pod hodnotou uvedenej (kyselina) produkuje menšie halo v aminoglykozidoch a makrolidoch (riziko falošnej rezistencie) a väčšie halo v penicilíne, tetracyklíne a novobiocíne (riziko falošnej citlivosti).

-Ak je pH vyššie ako uvedené (alkalické), vyššie opísané účinky sa obrátia.

-Médiá s vysokými koncentráciami tymínu a tymidínu významne ovplyvňujú inhibíciu halos sulfónamidov a trimetoprimu.

-Vysoké koncentrácie vápnika a horčíka spôsobujú falošnú rezistenciu aminoglykozidov, polymyxínu B a tetracyklínov proti kmeňom Pseudomonas aeruginosa.

-Nízke koncentrácie vápnika a horčíka vyvolávajú falošnú citlivosť aminoglykozidov, polymyxínu B a tetracyklínov proti kmeňom \ t Pseudomonas aeruginosa.

-Prítomnosť zinku ovplyvňuje výsledky karbapenémových diskov (imipeném, meropeném a ertapeném).

-Hrúbka média pod 3 mm vyvoláva falošnú citlivosť, zatiaľ čo hrúbka nad 5 vyvoláva falošnú rezistenciu.

-Mobilizácia diskov v antibiograme poskytne deformované halo, pretože antibiotický výtok je okamžitý.

- Veľmi slabé inokulum ovplyvňujú výsledky, pretože na agare nebude žiadny jednotný alebo súvislý rast, čo je nevyhnutnou podmienkou na to, aby bolo možné merať inhibičné zóny, okrem toho, že halo môžu poskytnúť väčšie ako normálne hodnoty..

-Preťažená inokula môže spôsobiť menšie halo než normálne.

-Nerešpektovanie vzdialenosti medzi diskami spôsobí, že jeden halo sa prekryje a nie je možné ho čítať správne.

-Inkubujte s CO2 zvyšuje veľkosť halos tetracyklínových a meticilínových diskov.

-Inkubácia pri teplotách pod 35 ° C produkuje väčšie halo.

-Prídavok krvi znižuje veľkosť halo sulfónamidov.

obmedzenia

Citlivosť antibiotika preukázaná na antibiograme proti mikroorganizmu (in vitro) nie je zárukou, že bude fungovať in vivo.

Kontrola kvality

Ak chcete vedieť, či médium obsahuje správne množstvo tymínu, musí sa zasiať kmeň Enterococcus faecalis ATCC 29212 a testuje náchylnosť na trimethoprim sulfametoxazol (SXT), aby sa dosiahol uspokojivý halo.

referencie

  1. "Agar Müller-Hinton." Wikipédia, slobodná encyklopédia. 16 november 2018, 12:23 UTC. 27. január 2019, 04:22
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Redakcia Panamericana S.A. Argentína.
  3. Podmienky pre dobrú štúdiu citlivosti agarovým difúznym testom. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
  4. Difco Francisco Soria Melguizo laboratórium. Müeller Hinton agar s 5% ovčej krvi. 2009. K dispozícii na adrese: http://f-soria.es
  5. Agar laboratória BD Müeller Hinton II. 2017. K dispozícii na adrese: .bd.com
  6. Laboratories Britania. Müeller Hinton agar. 2015. K dispozícii na adrese: britanialab.com
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Redakcia Panamericana S.A. Argentína.
  8. Martínez-Rojas D. Typ Betalactamasas AmpC: Všeobecne a metódy na fenotypovú detekciu. Soc. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. K dispozícii na: scielo.org.
  9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypová detekcia metallobetalaktamáz v klinických izolátoch Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. K dispozícii na: scielo.org.