Agar M.R.S nadácia, príprava a použitie



agar M.R.S. je selektívne tuhé kultivačné médium, ktoré sa používa na izoláciu a počítanie baktérií kyseliny mliečnej, najmä rodu Lactobacillus. Tento agar bol vytvorený v roku 1960 Man, Rogosa a Sharpe, stredný názov nesúci rovnaký názov, ale kvôli jeho zložitosti sa často používa skratka M.R.S..

Skladá sa z proteózového peptónu, mäsového extraktu, kvasinkového extraktu, glukózy, monolátu sorbitanu, fosforečnanu draselného, ​​octanu sodného, ​​citrátu amónneho, síranu horečnatého, síranu mangánu a agaru..

Táto kompozícia umožňuje správny vývoj baktérií mliečneho kvasenia z klinických vzoriek, ako sú výkaly, vaginálne sekréty, perorálne vzorky a mlieko, ako aj mliečne a mäsové potraviny..

V klinických laboratóriách sa bežne nepoužíva, pretože baktérie mliečneho kvasenia sa zriedkavo podieľajú na patologických procesoch. Použitie agaru M.R.S je však častejšie v oblasti potravinovej mikrobiológie..

Na druhej strane toto médium používajú niektoré výskumné centrá, ktorých cieľom je štúdium baktérií kyseliny mliečnej.

index

  • 1 Nadácia
  • 2 Príprava
  • 3 Použitie
    • 3.1 Charakteristiky kolónií
    • 3.2 Izolácia baktérií kyseliny mliečnej
    • 3.3 Počítanie baktérií kyseliny mliečnej
    • 3.4 Na úrovni výskumu
  • 4 Kontrola kvality
  • 5 Referencie

nadácie

Agar Man, Rogosa a Sharpe má pomerne zložité zloženie. Rozdelením funkcie, ktorú plní každá z jej zložiek, možno vysvetliť jej základ.

Proteózový peptón, mäsový extrakt, kvasinkový extrakt a glukóza sú živiny, ktoré poskytujú zdroj uhlíka, dusíka, vitamínov a minerálov potrebných na rast baktérií. Okrem toho je glukóza univerzálnym zdrojom energie používaným vo väčšine kultivačných médií.

Na druhej strane, aby sa podporil rast baktérií kyseliny mliečnej, je nevyhnutná prítomnosť nevyhnutných kofaktorov (katiónov) v metabolizme Lactobacillus a príbuzných baktérií; Tieto zlúčeniny sú sodné, horečnaté a mangánové soli.

Podobne, sorbitan monoleát alebo polysorbát 80 sú zdrojom dôležitých mastných kyselín, keď sú absorbované ako živiny..

Okrem toho sorbitanmonolát a citrát amónny pôsobia tak, že inhibujú rozvoj sprievodnej flóry, najmä gramnegatívnych baktérií, ktoré poskytujú selektívny charakter tohto agaru..

Nakoniec agar-agar je to, čo dáva pevnú konzistenciu médiu.

Existujú aj ďalšie varianty agaru Man Rogosa Sharpe; jeden z nich je doplnený o cysteín (M.R.S.c), veľmi užitočný na izoláciu bifidobaktérií, medzi inými mikroorganizmami. Na druhej strane je médium MRS doplnené neomycínom, paromomycínom, kyselinou nalidixovou a chloridom lítnym, najmä na selektívne počítanie bifidobaktérií v mliečnych výrobkoch..

príprava

Odváži sa 68,25 g dehydratovaného média a rozpustí sa v jednom litri destilovanej vody. Nechajte stáť 5 minút. Aby sa rozpustil v plnom rozsahu, miešajte často na zdroj tepla a nechajte variť 1 až 2 minúty. Sterilizujte v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút.

Keď opúšťate autokláv, nechajte niekoľko minút odstáť a rozdeľte ho stále v sterilných Petriho miskách.

Nechajte tuhé a invertovať platne, objednajte ich v plaquers a skladujte v chladničke až do použitia. Pred použitím nechajte platne odobrať izbovú teplotu.

Hodnota pH média by mala byť 6,4 ± 0,2. Niektoré komerčné domy odporúčajú pH medzi 5,5 až 5,9.

Dehydrované médium je béžové a pripravené je tmavo jantárové.

Dehydratované médium a pripravené platne by sa mali skladovať pri teplote 2 až 8 ° C.

aplikácie

Agarové platne M.R.S. môžu byť zasiate na povrch (vyčerpanie alebo špachtľou Drigalski). Môže sa tiež zasiať do hĺbky. Platne by sa mali inkubovať pri teplote 37 ° C v mikroaerofilnom prostredí (4% O2 a 5-10% CO2) počas 24 až 72 hodín.

Spôsob výsevu sa volí podľa sledovaného účelu (izolácia alebo počítanie)..

Charakteristiky kolónií

Predpokladané kolónie Lactobacillus rastú belavo a majú na tomto agare mukoidný alebo krémový vzhľad. Potom sa musia identifikovať.

Izolácia baktérií kyseliny mliečnej

Na tento účel sa používa výsadba po povrchu. Vzorky, ktoré sa majú zasadiť, vyžadujú predchádzajúci postup. 

V prípade vzoriek materského mlieka sa odporúča odstreďovať 1 ml vzorky pri 14 000 rmp počas 10 minút, aby sa odstránila mastná vrstva. 900 μl sa vyhodí a vo zvyšných 100 μl sa sediment suspenduje a naleje na M.R.S. Potom sa musí rovnomerne rozložiť špachtľou Drigalski.

V prípade vzoriek stolice sa jeden (1) gram stolice odváži a homogenizuje v 9 ml 0,1% sterilnej peptonovanej vody, čo zodpovedá zriedeniu 1/10. Potom sa uskutočnia sériové riedenia, až kým sa nedosiahne konečné riedenie 10-4.

Nakoniec sa odoberie 100 ul zriedení 10-2, 10-3 a 10-4 a každé riedenie sa naočkuje na MRS agar, pričom sa rovnomerne rozdelí pomocou špachtle Drigalski.

Počítanie baktérií kyseliny mliečnej

V tomto prípade sa výsev vykonáva hĺbkou.

Pri vzorkách materského mlieka vezmite 1 ml a vložte ho do sterilnej kónickej plastovej skúmavky. MRS agar sa pridá pri teplote približne 40 ° C až do konečného objemu 25 ml, čím sa získa homogénna zmes. Následne sa rovnomerne naleje do sterilných Petriho misiek a nechá sa stáť, až sa polymerizuje..

Riedenia sa uskutočňujú pre vzorky stolice, ako je opísané vyššie. Odoberte 1 ml každého riedenia a umiestnite do sterilných kónických plastových skúmaviek. Roztavený MRS agar sa pridá do objemu 25 ml.

Zmes každého riedenia sa rovnomerne naleje do sterilných Petriho misiek. Nakoniec sa nechá stáť až do polymerizácie.

Na úrovni výskumu

Štúdium baktérií mliečneho kvasenia sa stáva každým dňom zaujímavejším; najmä výskumníci sa snažia spoznať nové kmene a ich potenciál ako iniciovať fermenty na normalizáciu vo výrobe mliečnych výrobkov, okrem iného.

V tomto zmysle Alvarado et al. (2007) použili agar M.R.S. vykonať štúdiu, v ktorej izolovali, identifikovali a charakterizovali baktérie mliečneho kvasenia prítomné v remeselnom údenom venezuelskom syre.

V syre zistili prítomnosť baktérií rodov Lactococcus a Lactobacillus a dospeli k záveru, že zmesi izolovaných kmeňov sú vhodné ako štartovacie kmene pri výrobe syrov z pasterizovaného mlieka..

Na druhej strane, Sánchez et al. (2017) použitý agar M.R.S. skúmať prítomnosť baktérií mliečneho kvasenia v zažívacom trakte prasiatok s cieľom ich použitia ako prirodzených probiotík, ktoré zvyšujú produktivitu zdravých prasiatok \ t.

Týmto médiom sa podarilo izolovať štyri druhy: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae a Pediococcus pentosaceus.

Podobne Báez a kol. (2019) použitý agar M.R.S. vyhodnotiť baktérie mliečneho kvasenia (BAL) a bifidobaktérie s probiotickým potenciálom v materskom mlieku a stolici dojčiat.

Podarilo sa im izolovať 11 BAL a 3 Bifidobacteria sp v materskom mlieku a 8 BAL a 2 Bifidobacteria sp. v stolici Všetci splnili určité parametre, ktoré ich akreditujú ako baktérie s probiotickou aktivitou.

Autori dospeli k záveru, že ako prirodzené zdroje probiotických baktérií slúžia ako materské mlieko, tak výkaly výlučne dojčených detí.

Kontrola kvality

Na vyhodnotenie kvality M.R.S. kontrolné kmene, ako napríklad: \ t

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli a Bacillus cereus.

Očakávané výsledky sú uspokojivý rast pre prvých 6 baktérií, zatiaľ čo E. coli a Bacillus cereus musí byť zablokovaný ako celok.

referencie

  1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Izolácia, identifikácia a charakterizácia baktérií kyseliny mliečnej z andského ručne vyrábaného údeného venezuelského syra. Jeho použitie ako štartovacej kultivácie. Prevodovkám. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. K dispozícii na: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro izolácia baktérií kyseliny mliečnej z tráviaceho traktu prasiat. Rev. vet. Peru 2017; 28 (3): 730-736. K dispozícii na: scielo.org.
  3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Hodnotenie baktérií mliečneho kvasenia a bifidobaktérií s probiotickým potenciálom v materskom mlieku a výkaloch dojčiat v obci Acevedo, Miranda 2017. Bakalárske práce na získanie bakalárskeho titulu v odbore biotesty. Univerzita Carabobo, Venezuela.
  4. Britské laboratórium Agar M.R.S. 2015. K dispozícii na adrese: britanialab.com
  5. Prispievatelia Wikipédie. MRS agar Wikipédia, Voľná ​​encyklopédia. 10. január 2018, 19:44 UTC. K dispozícii na adrese: wikipedia.org Prístup k 17. februáru 2019.
  6. Roy D. Médiá na izoláciu a stanovenie počtu bifidobaktérií v mliečnych výrobkoch. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.