Agar má štandardný základ, prípravu a použitie

štandardný účtovný agar je tuhé neselektívne kultivačné médium určené na kvantifikáciu aeróbnej mikrobiálnej záťaže prítomnej vo vzorkách pitnej vody, odpadových vôd, mliečnych nápojov, okrem iných potravín. Toto médium je tiež známe ako agar PCA, akronym v angličtine Plate Count Agar. Bol vytvorený v roku 1953 Buchbinderom, Barisom a Goldsteinom.

Štandardné agarové médium sa skladá z kvasnicového extraktu, tripteínu, glukózy, agaru a destilovanej vody. Táto formulácia obsahuje základné nutričné ​​prvky, ktoré umožňujú rozvoj súčasnej aeróbnej mikrobiálnej záťaže, ktorá nie je náročná.

Keďže médium neobsahuje inhibítory, baktérie sa môžu vyvíjať bez akýchkoľvek obmedzení, takže je ideálny pre celkový počet kolónií. Technika kvantifikácie doštičiek však nedeteguje všetky prítomné baktérie, ale iba tie, ktoré sú schopné rásť za podmienok prostredia, ktorým je vystavený štandardný siatý agar..

V tomto zmysle sa metóda kvantifikácie dosiek snaží všeobecne stanoviť množstvo aeróbnych baktérií mezofilného typu, to znamená tých, ktoré sa vyvíjajú pri teplotách medzi 25 a 40 ° C, s optimálnou teplotou rastu pri 37 ° C..

Táto bakteriálna skupina je veľmi dôležitá, pretože pre človeka existuje väčšina patogénnych baktérií.

Treba poznamenať, že niekedy môže byť zaujímavé kvantifikovať množstvo psychrofilných baktérií prítomných v potravinách. Tieto baktérie sa vyvíjajú pri nízkych teplotách (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Podobne termofilné baktérie, ktoré sa vyvíjajú v rozmedzí od 50 ° C do 80 ° C alebo viac, môžu byť dôležité pri určitých druhoch potravín, ako sú konzervy..

Mikrobiálna kvantifikácia sa vyjadruje v jednotkách tvoriacich kolónie (CFU) na gram alebo mililiter vzorky.

index

• 1 Nadácia
• 2 Príprava
  • 2.1 Technika nalievania doštičiek
  • 2.2 Na sadenie
• 3 Použite
  • 3.1 Technika liatia dosiek (naočkovaná hĺbkou)
  • 3.2 Technika zasiata na povrch
• 4 Kontrola kvality
• 5 Obmedzenia
• 6 Referencie

nadácie

Štandardné počítacie médium je navrhnuté tak, aby umožňovalo uspokojivý vývoj nenáročných aeróbnych baktérií, pretože kvasničný extrakt, tripheín a glukóza poskytujú potrebné živiny pre dobrý mikrobiálny vývoj..

Na druhej strane má médium číre sfarbenie a transparentný vzhľad, preto je ideálny na zobrazovanie kolónií vyvinutých metódou hlbokého výsevu (nalievanie do misky)..

Je tiež možné počítať kolónie spôsobom výsevu na povrchu špachtľou Drigalski.

Ak je mikrobiálna záťaž vysoká, musia sa vykonať desatinné riedenia skúmanej vzorky, aby sa mohli spočítať CFU..

Je potrebné poznamenať, že toto médium odporúča Americká asociácia verejného zdravotníctva (APHA) na počítanie aeróbnych mezofilov.

príprava

Odváži sa 23,5 g dehydratovaného média a rozpustí sa v jednom litri destilovanej vody. Aby sa zmes úplne rozpustila, musí sa často zahrievať, kým sa nezohreje. Následné kroky závisia od použitej očkovacej techniky.

Pre techniku ​​nalievania doštičiek

Rozdeľte 12 až 15 ml do skúmaviek. Následne sterilizujte v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút. Nechajte vertikálne stuhnúť vo forme bloku. Uchovávajte v chladničke až do použitia.

Roztopte tágo, keď sa bude používať. Po roztopení ho uchovávajte vo vodnom kúpeli pri teplote 44 - 47 ° C počas prípravy vzoriek.

Na výsadbu na povrchu

Médium sa sterilizuje v autokláve pri 121 ° C a potom sa 20 ml rozdelí do sterilných Petriho misiek. Nechajte tuhnúť, invertovať a skladovať v chladničke až do použitia.

Platne pred použitím temperujte. Hodnota pH média by mala byť 7,0 ± 0,2.

použitie

Počet agarových štandardov sa používa v aeróbnej mezofilnej metóde pri mikrobiologickej analýze vody a potravy. Počítanie aeróbnych mezofilov je nevyhnutné, pretože určuje hygienickú kvalitu študovanej vzorky.

Aplikácia tejto techniky (pomocou tohto média) umožňuje makroskopickú vizualizáciu izolovaných kolónií na ich kvantifikáciu.

Technika liatia plakov (naočkovaná hĺbkou)

-proces

Technika pozostáva z nasledovného:

1) Homogenizuje sa vzorka, aby sa baktérie rozložili.

2) Počiatočná suspenzia sa vykonáva v sterilnej liekovke alebo sáčku, pričom sa dodržiava pomer 10 g alebo 10 ml vzorky v 90 ml rozpúšťadla (10 \ t^-1).

3) Z počiatočnej suspenzie sa urobia príslušné desatinné riedenia v závislosti od typu vzorky. Príklad: (10)^-2, 10^-3, 10^-4). Riedenia sa uskutočňujú s peptónovou vodou alebo fosfátovým pufrom.

Za týmto účelom odoberte 1 ml východiskovej suspenzie a vložte do 9 ml riedidla, v prípade potreby pokračujte v riedeniach, pričom odoberte 1 ml zriedenia.^-2 a tak ďalej.

4) Odoberte 1 ml každého riedenia a vložte do prázdnych sterilných Petriho misiek.

5) Do každej platne sa pridá 12 až 15 ml štandardného množstva agaru, ktorý sa predtým roztavil a nastaví na 44 až 47 ° C.

6) Podávajte platne hladké rotačné pohyby, aby sa vzorka rovnomerne rozložila na agar a umožnila stuhnúť.

7) Doštičky sa reverzujú a inkubujú sa pri teplote 37 ° C v aerobióze počas 24 až 48 hodín.

8) Akonáhle čas skončí, pokračujte v skúmaní platní a spočítajte kolónie v riedení, ktoré to umožňuje. Vyberá sa na počítanie tých dosiek, ktoré majú od 30 do 300 CFU.

Počítanie sa môže vykonať ručne alebo sa môže použiť počítadlo kolónie.

Povolené hodnoty na ml vzorky sa môžu v jednotlivých krajinách líšiť podľa noriem, ktorými sa riadia.

-Výpočet UFC

Všeobecný výpočet sa vykoná pomocou tohto vzorca:

Výsledky vyjadrite v 1 alebo 2 čísliciach, vynásobte príslušnou bázou 10. Príklad: ak je výsledok 16.545, zaokrúhľuje sa na tretiu číslicu na 17.000 a bude vyjadrený takto: 1.7 x 10⁴. Ak je výsledok 16 436, zaokrúhli sa na 16 000 a vyjadruje sa 1,6 x 10⁴.

Technika zasadená na povrchu

-proces

-Inokulujte 0,1 ml priamej vzorky, ak je kvapalná, počiatočná suspenzia 10^-1 alebo po sebe idúcich riedení 10^-2, 10^-3 atď., uprostred štandardnej agarovej platne.

-Vzorku rovnomerne rozložte špachtľou Drigalski alebo sklenenou tyčinkou tvaru L. Nechajte odstáť 10 minút.

-Reverzujte platne a inkubujte v aerobióze pri 37 ° C počas 24 až 48 hodín.

-Pokračujte v počítaní kolónií, vyberte tie platne, ktoré sú v rozsahu 20 - 250 CFU.

-Výpočet UFC

Na výpočet sa použije faktor riedenia, ktorý je inverzný. Číslo je zaokrúhlené na 2 významné číslice (zaokrúhľovanie podľa tretej číslice) a je vyjadrené v základni 10. Napríklad, ak sa vo vzorke počíta bez 224 CFU bez riedenia (10^-1), Uvádza sa 22 x 10¹  UFC, ale ak je hodnota 225, uvádza sa 23 x 10¹ UFC.

Teraz, ak počítate 199 CFU v riedení 10^-3, 20 x 10⁴ UFC, ale ak sa 153 CFU spočíta v rovnakom riedení, uvedie sa 15 x 10⁴ UFC.

Kontrola kvality

Štandardné kultivačné médium sa môže vyhodnotiť použitím známych certifikovaných kmeňov, ako sú: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Ak je kultivačné médium v ​​optimálnych podmienkach, očakáva sa uspokojivý rast vo všetkých prípadoch, s výnimkou L. fermentum ktoré môžu mať pravidelný výkon.

Na vyhodnotenie sterility kultivačného média by sa jedna alebo dve platničky z každej pripravenej dávky (neoočkovanej) mali inkubovať pri 37 ° C v aerobióze počas 24 hodín. Na konci tejto doby sa nesmie pozorovať žiadny rast ani zmena farby média..

obmedzenia

-Agar nerozpúšťajte viac ako raz.

-Pripravené médium môže trvať až 3 mesiace, pokiaľ je uchovávané v chladničke a chránené pred svetlom.

-Toto médium nie je vhodné pre náročné mikroorganizmy ani anaeróby.

referencie

1. Národná správa potravinárskych a zdravotníckych technológií (ANMAT). Mikrobiologická analýza potravín, oficiálna analytická metodika, indikátorové mikroorganizmy. Ročník 2014. K dispozícii na: anmat.gov.ar
2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Agar s počtom platní. 2009. K dispozícii na adrese: http://f-soria.es
3. Laboratóriá Conda Pronadisa. Agar pre štandardné metódy (PCA) podľa APHA a ISO 4833. K dispozícii na: condalab.com
4. Laboratories Britania. Počítanie na agarovej platni. 2015. K dispozícii na adrese: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B a Velázquez O. 2009. Techniky mikrobiologickej analýzy potravín. 2. vydanie. Fakulta chemická, UNAM. Mexiko. K dispozícii na adrese: depa.fquim.unam