Voges-Proskauer test základ, príprava a použitie



Voges-Proskauerov test je biochemický test, ktorý sa používa na identifikáciu baktérií patriacich do čeľade Enterobacteriaceae. Zvlášť je užitočné rozlišovať kmene Escherichia coli z Klebsiella a Enterobacter, medzi inými.

Test sa uskutočňuje v kvapalnom kultivačnom médiu nazývanom metylčervený-Voges Proskauer, lepšie známy pod skratkou RM / VP. Toto médium sa skladá z pufrovaného polypeptidu, glukózy, fosforečnanu draselného a destilovanej vody.

Súčasné médium RM / VP je modifikáciou média Clark a Lubs, ktoré pôvodne obsahovalo nižšiu koncentráciu peptonov a glukózy. Preto sa produkovalo menej vodíkových iónov, ktoré sú potrebné pre pozitívnu Voges-Proskauerovu reakciu.

Test je založený na schopnosti mikroorganizmu používať glukózu cestou butylénglykolu a vytvárať neutrálny konečný produkt nazývaný acetoín v prítomnosti kyslíka a alkalického pH..

V médiu RM / VP sa okrem toho, že je schopný odhaliť Voges-Proskauerov test, môže byť tiež odhalený test metylovej červene.

index

  • 1 Nadácia
    • 1.1 Základ Voges-Proskauerovho testu
    • 1.2 Základ pre vypracovanie testu a interpretácie
  • 2 Príprava
    • 2.1 Médium RM / VP
    • 2.2 Činidlo Voges A
    • 2.3 Činidlo Voges B
  • 3 Postup testu Voges-Proskauer
    • 3.1 Vývoj testu
  • 4 Použite
  • 5 Kontrola kvality
  • 6 Referencie

nadácie

Základ Voges-Proskauerovho testu

Pluripeptony prítomné v médiu poskytujú nutričné ​​požiadavky nevyhnutné pre rast baktérií. Hlavnou zlúčeninou je glukóza. Mnohé baktérie majú schopnosť metabolizovať glukózu a vytvárať kyselinu pyrohroznovú.

Kyselina pyrohroznová je stredným bodom metabolizmu glukózy a odtiaľ každý mikroorganizmus môže mať rôzne cesty. Niektoré budú tvoriť zmiešané kyseliny, ako je kyselina mliečna, kyselina octová, kyselina mravčia a kyselina jantárová, a iné budú tvoriť neutrálne produkty, ako je 2,3-butándiol..

Voges-Proskauerov test ukazuje schopnosť mikroorganizmu tvoriť acetylmetylkarbinol (acetoín), medziprodukt produktu 2,3-butándiolu za aeróbnych podmienok.

Acetoín sa redukuje a tvorí 2,3-butándiol, ale táto reakcia je reverzibilná, takže ak sa oxiduje 2,3-butándiol, vytvára sa acetoín. Preto je nevyhnutný kyslík.

Fosforečnan draselný je tlmivý roztok, ktorý tlmí zmes pri pH 6,9 ± 0,2..

Základ pre vypracovanie testu a interpretáciu

Na preukázanie reakcie sa musí vykonať vývoj pomocou dvoch činidiel (Barritove činidlá), známych ako Voges A a Voges B.

Voges A je 5% roztok a-naftolu a Voges B je 40% roztok hydroxidu draselného. Ak hydroxid draselný nie je k dispozícii, môže byť nahradený 40% hydroxidom sodným.

Α-naftol je katalyzátor, ktorý zvýši intenzitu farby reakcie, čo robí test citlivejším. Najprv sa musí pridať a-naftol, pričom sa skúmavka mieša tak, aby médium prišlo do styku s kyslíkom. Týmto spôsobom je prítomný acetoín oxidovaný na diacetyl a 2,3-butándiol je oxidovaný na acetoín, pričom ho prechádza do diacetylu..

To je, ako sa a-naftol viaže na diacetyl, ktorý je zase spojený s guanidínovým jadrom prítomným v aminokyseline arginínu, ktorý pochádza z pluripeptonov.

Hydroxid draselný alebo sodný je zodpovedný za absorpciu CO2 a reagujú s peptonmi. Táto reakcia spôsobuje tvorbu ružovo-lososovej farby, jasne viditeľnej po veľmi dobrom pretrepaní skúmavky.

Aby sa sfarbenie vyskytlo okamžite, musia sa zmiešať správne množstvá diacetylu, peptónu a a-naftolu. Ak sa tak nestane, nechajte skúmavku odpočívať 15 minút pred tlmočením.

Zvyčajne je test pozitívny po 2 až 5 minútach, keď je možné pozorovať slabo ružovú farbu. Ak zostane v pokoji 30 minút až 1 hodinu, intenzita farby bude maximálna (tmavo červená).

Negatívny test bude zrejmý, keď je bujón žltý. Ak je test negatívny, môže sa po 1 hodine vytvoriť farba medi ako výsledok reakcie hydroxidu draselného na α-naftol..

príprava

Médium RM / VP

Navážte 17 g dehydratovaného kultivačného média a rozpustite v jednom litri destilovanej vody. Nechajte stáť 5 minút. Zahrievajte až do varu, aby sa úplne rozpustila. Podávajte 3 až 4 ml v skúmavkách a sterilizujte v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút.

Dehydratované kultivačné médium je béžové a pripravené médium je svetlo jantárové.

Konečné pH média je 6,9 ​​± 0,2.

Činidlo Voges A

Navážte 5 g α-naftolu a rozpustite v 50 ml etylalkoholu (absolútne). Následne pokračujte v pridávaní etylalkoholu až do objemu 100 ml.

Činidlo Voges B

Navážte 40 g hydroxidu draselného a rozpustite v 50 ml destilovanej vody v kadičke. Sklo by sa malo umiestniť do studeného vodného kúpeľa, aby sa kontrolovala teplota, pretože v čase rozpúšťania prípravok prudko stúpa.

Potom, čo je roztok studený, sa prenesie na odmerný balónik a doplní na 100 ml destilovanou vodou.

Postup Voges-Proskauerovho testu

Na uskutočnenie Voges-Proskauerovho testu sa živná pôda RM / VP naočkuje študovaným mikroorganizmom z čistej kultúry 18 až 24 hodín..

Inokulum by nemalo byť príliš husté. Inkubuje sa pri teplote 35 až 37 ° C počas 24 až 48 hodín, aj keď niekedy je inkubácia potrebná niekoľko dní. Cowan a Steel veria, že 5 dní je minimálna doba inkubácie potrebná na zistenie všetkých pozitívnych druhov Voges-Proskauer (VP) z čeľade Enterobacteriaceae.

Vývoj testu

Alikvotná časť s objemom 1 ml sa oddelí v skúmavke a vývoj sa vykoná nasledovne: umiestni sa 12 kvapiek (0,6 ml) činidla Voges A a 4 kvapky (0,2 ml) Voges B. Premieša sa, aby sa prevzdušnilo a nechalo sa stáť. pred vykonaním. Ak je však test stále negatívny, nechajte ho stáť a skúmajte skúmavku po 30 minútach až 1 hodine.

Vzhľad ružovo-červenej farby naznačuje, že Voges-Proskauerova reakcia je pozitívna. Ak médium zostane žlté, reakcia je negatívna.

Prídavok vývojárov v uvedenom poradí a množstve je nevyhnutný na zabránenie falošným negatívam.

použitie

Voges-Proskauerov test je vhodný na rozlíšenie medzi kmeňmi E. coli ktoré sú VP negatívne, z rodov Klebsiella, Enterobacter, Serratia, okrem iného, ​​ktoré sú VP pozitívne.

Kontrola kvality

Kontrolné kmene sa môžu použiť na testovanie kvality pripraveného média. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium a Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Očakávané výsledky sú pozitívne Voges-Proskauerove reakcie len pre K. pneumoniae a E. cloacae. Zvyšok dáva negatívne reakcie.

referencie

  1. Laboratories Britania. MR-VP Medium. 2015. Dostupné na: www.britanialab.com
  2. Laboratóriá Microkit M-Ident Voges Proskauer. 2014. K dispozícii: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy na identifikáciu klinicky významných baktérií. 3. vydanie. Redakčná Panamericana. Buenos Aires Argentína.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Redakcia Panamericana S.A. Argentína.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Redakcia Panamericana S.A. Argentína.