Zdieľam:
DNA sekvenovanie Maxam-Gilbert, Sangerova metóda, príklady
DNA sekvenovanie (deoxyribonukleová kyselina) je postup v laboratóriách molekulárnej biológie, ktorý umožňuje poznať poradie nukleotidov v sledovanom genetickom materiáli. Okrem toho môže byť tiež odhalené sekvenovanie RNA (ribonukleová kyselina).
Táto technika bola nevyhnutná pre rozvoj biologických vied. Uplatňuje sa aj na iné oblasti vedomostí - napríklad na lekársku diagnózu a forenzné vyšetrovanie.
Predtým bolo sekvenovanie reťazca DNA považované za pomalú a nákladnú aktivitu, ktorá umožnila identifikáciu len niekoľkých párov báz v oligonukleotidoch..
V súčasnej dobe, so všetkými pokroky vedy, DNA sekvencovanie je rutinná operácia v mnohých laboratóriách po celom svete vďaka príspevku takmer 50 rokov výskumu v tejto oblasti. Pokiaľ ide o dĺžku reťazca, môžete postupovať až do miliónov bázových párov vo veľmi krátkom čase.
Na to existujú desiatky vyvinutých techník, ktoré sa líšia cenou a presnosťou. V tomto článku popíšeme klasické aj moderné techniky, z ktorých každá má svoje výhody a nevýhody.
Techniky sekvencovania dovoľujú získať sekvenciu kompletných genómov, od malých prokaryotov a kvasiniek až po ľudský genóm..
index
- 1 Štruktúra DNA
- 2 História
- 3 Sangerova metóda
- 3.1 Hlavné zložky reakcie
- 3.2 Prečítanie výsledkov
- 4 Automatické sekvencovanie
- 5 Maxam-Gilbert sekvenovanie
- 5.1 Postup
- 5.2 Prečítanie výsledkov
- 6 Masívne sekvenovanie
- 6.1 Pyrosekvenovanie
- 6.2 Sekvenovanie syntézou
- 6.3 Sekvenovanie ligáciou
- 6.4 Sekvencovanie Ion Torrent
- 7 Príklady
- 7.1 Sekvenovanie ľudského genómu
- 8 Význam a aplikácie
- 9 Referencie
Štruktúra DNA
Na pochopenie metód a techník používaných na sekvenovanie DNA je potrebné poznať určité kľúčové aspekty štruktúry a zloženia molekuly.
DNA je biomolekula nachádzajúca sa vo všetkých živých organizmoch, od baktérií po veľké vodné živočíchy. Organely - ako mitochondrie a chloroplasty - majú v sebe kruhovú molekulu DNA. Aj v niektorých vírusoch je genetickým materiálom DNA.
Štruktúrne je DNA súbor nukleotidov. Každá z nich je integrovaná sacharidom, dusíkatou bázou (A, T, C alebo G) a fosfátovou skupinou. Cieľom sekvenovania DNA je odhaliť poradie, v ktorom sa nachádzajú štyri dusíkaté bázy v sekvencii.
histórie
V polovici 50. rokov výskumníci Watson a Crick opísali štruktúru DNA pomocou Christologických techník. Žiadny z týchto výskumníkov však nebol schopný nájsť spôsob, ako odhaliť postupnosť.
Hoci tam boli istí predchodcovia, najdôležitejšou udalosťou bolo vytvorenie Sangerovej metódy, v roku 1977. Frederick Sanger, otec metódy, bol britský biochemik, víťaz dvoch Nobelových cien za jeho obrovské príspevky k biologickým vedám.
Táto technika je v literatúre tiež známa ako "ukončenie reťazca" alebo dideoxynukleotidy. Ďalej popíšeme princípy tejto techniky a tie, ktoré boli vyvinuté na základe zlepšenia a inovácie.
Sangerova metóda
Vývoj Sangerovej metódy predstavoval kľúčovú udalosť v molekulárnej biológii. Zahŕňa základné zložky procesu replikácie DNA, ktorý sa normálne vyskytuje v bunke, ale pridaním špeciálnej zložky: dideoxynukleotidy.
Hlavné zložky reakcie
- DNA polymeráza: enzým DNA polymeráza je kľúčovým prvkom procesu. Táto molekula sa podieľa na replikácii reťazca DNA a jeho úlohou je syntéza nového reťazca, pričom sa zhoduje s trifosfátom deoxyribonukleotidov s komplementárnymi..
Pamätajte, že v DNA sú tymíny (T) spárované s adenínmi (A) pomocou dvoch vodíkových väzieb, zatiaľ čo cytozín (C) sa s guanínom (G) delí tromi mostíkmi.
- Nukleotidy: Sekvenovanie Sanger zahŕňa dva typy nukleotidov, štyri 2'-deoxynukleotidy (skrátene dATP, dGTP, dCTP a dTTP) a štyri dideoxynukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP).
Hoci dideoxynukleotidy sú podobné monomérom, ktoré sú normálne inkorporované do DNA, nemajú vo svojej štruktúre skupinu -OH. To znemožňuje pridanie nového nukleotidu do reťazca.
Preto, keď sa k reťazcu vo vytvorení pridáva špeciálny nukleotid - úplne náhodným spôsobom - syntéza je paralyzovaná. Týmto spôsobom na konci reakcie existujú reťazce rôznych veľkostí, z ktorých každá je zastavená v inom bode.
Experimentálne sa pripravia štyri pokusy. Každá obsahuje DNA extrahovanú z požadovanej biologickej vzorky, normálne nukleotidy a jeden zo štyroch typov špeciálnych nukleotidov. Alebo sú špeciálne nukleotidy označené nejakým typom fluorescenčného markera (pozri nižšie automatizované sekvenovanie).
Čítanie výsledkov
Prvým krokom je oddelenie každého zo syntetizovaných reťazcov podľa ich veľkosti. Niektoré budú dlhšie ako iné, v závislosti od toho, kde boli špeciálne základne začlenené.
Existujú rôzne biochemické techniky, ktoré umožňujú separáciu zložiek zmesi použitím veľkosti ako diskriminačnej vlastnosti. V Sangerovej metóde sa rôzne reťazce oddelia elektroforézou. V najsofistikovanejších variantoch techniky sa používa kapilárna elektroforéza.
Čím dlhšie vlákna sa tak pohybujú menej ako kratšie varianty. Potom tento systém prechádza cez čítačku, ktorá rozpoznáva marker obsiahnutý v každom dideoxynukleotide. Týmto spôsobom môže byť známe poradie sekvencie.
Táto technika "prvej generácie" je schopná čítať fragmenty DNA nie väčšie ako 1 kilobáza. Sangerova metóda sa v súčasnosti používa vo viacerých laboratóriách, vo všeobecnosti v moderných variantoch. Okrem toho sa používa na potvrdenie výsledkov získaných najkomplexnejšou technikou - ale menej presnou.
Automatické sekvenovanie
Keď je potrebné rozsiahle sekvenovanie, proces sa urýchli automatizáciou. Toto je variácia metódy terminácie Sangerovho reťazca, kde priméry sú označené fluorescenčnými produktmi, aby sa odlíšili.
Následne sa produkt reakcie uskutočňuje elektroforézou - to všetko v jedinom pruhu. Keď každý fragment opustí poslednú časť gélu, rýchlo sa identifikuje pomocou fluorescenčnej značky s chybou, ktorá obklopuje 1%.
Najsofistikovanejšie systémy majú systém až 96 kapilárnych trubíc ovládaných počítačom spojeným s robotom. To znamená, že 96 vzoriek DNA sa môže vyhodnotiť súčasne. Proces zahŕňajúci elektroforézu a analýza výsledkov je teda úplne automatizovaný.
Za jeden deň môžu tieto systémy sekvenovať až 550 000 báz. Počas procesu je ľudská práca zbytočná, spustenie metódy trvá len asi 15 minút.
Sekvenovanie Maxam-Gilbert
V tom istom čase, keď Sanger publikoval svoju prácu, sa dvom výskumníkom menom Allan Maxan a Walter Gilbert podarilo vyvinúť inú metódu na získanie sekvencie DNA. Metóda v tom čase získala popularitu, ale neskôr bola nahradená vylepšením Sangerovej metódy.
Na rozdiel od Sangerovej metódy, sekvenovanie Maxana a Gilberta (alebo chemického sekvenovania, ako je známe) nezahŕňa hybridizačné reakcie. Metodológia pozostáva z označovania reaktívnymi činidlami na jednom konci, po ktorom nasleduje proces čistenia.
Jedným z negatívnych aspektov tejto techniky je jej obrovská komplexnosť a použitie chemikálií, ktoré sú pre používateľa nebezpečné. Chemické poruchy sú vyvolané aplikáciou DMS, kyseliny mravčej, hydrazínu a hydrazínu so soľami.
proces
Protokol začína značením na 5 'konci vlákna fosforovým markerom 32, potom dochádza k chemickej modifikácii dusíkatej bázy a táto je oddelená. Nakoniec dochádza k deleniu abázickej oblasti.
Najprv sa reťazec, ktorý sa má sekvenovať, skracuje na menšie segmenty. Tento krok sa uskutočňuje reštrikčnými enzýmami, čo vedie k výnimočným extrémom.
Ďalej sa reakcia uskutočňuje s alkalickou fosfatázou, ktorej účelom je eliminácia fosfátovej skupiny. Polynukleotidkináza sa teda môže použiť na značenie.
Reťazec je denaturovaný (dve vetvy sú otvorené). Potom pokračujeme v aplikácii chemikálií. Tieto štiepne reakcie sa uskutočňujú kontrolovaným spôsobom a aké typy väzieb sa rozložia pri každej použitej chemikálii.
Čítanie výsledkov
Ako v Sangerovej metóde, aj odčítanie výsledkov zahŕňa separáciu reťazcov získaných elektroforéznym systémom podľa veľkosti. Systémy zložené z polyakrylamidu umožňujú získať veľmi primerané rozlíšenie na čítanie gélu.
Masívne sekvenovanie
Masívne sekvenovanie zahŕňa sériu nových metód, skrátene NGS, z angličtiny "Sekvenovanie nasledujúcej generácie ".
Metódy katalogizované ako NGS vyžadujú predchádzajúci krok amplifikácie DNA (nepracujú s jednou molekulou). Okrem toho sa používané platformy značne líšia. Princípy najpopulárnejších metód budú opísané nižšie:
pyrosekvenování
Zahŕňa monitorovanie uvoľňovania pyrofosfátu, ku ktorému dochádza vždy, keď sa k DNA reťazcu pridá nový nukleotid. Enzymový systém je spojený, takže emisia svetla (ktorá je detegovateľná kamerou) nastáva vždy, keď je začlenený nový nukleotid.
Proces začína samostatnou inkubáciou každej dusíkatej bázy, aby sa overilo, či dochádza k vyžarovaniu svetla. Pyrosequencing môže vykonávať čítanie dlhých vlákien, ale zistená chybovosť je vysoká.
Sekvenovanie syntézou
To zahŕňa začlenenie značených nukleotidov. Tieto fluorescenčné zložky sa pridajú, premyjú a zapíše sa začlenený nukleotid. Potom sa eliminuje nukleotidové značenie a syntéza vlákna môže pokračovať. V ďalšom kroku bude tiež začlenený označený nukleotid a uvedené kroky budú opakované.
Jednou z nevýhod tejto techniky je, že fluorescenčné markery nie sú úplne eliminované. Tieto emisie vytvárajú chyby pozadia, čo vedie k významným chybám.
Sekvenovanie ligáciou
Táto technika sa líši od ostatných, pretože nepoužíva DNA polymerázu. Kľúčovým enzýmom pre túto metodológiu je ligáza. Používajú sa tu fragmenty DNA fluorescenčne značené, viazané enzýmom a detegované.
Najväčším problémom tejto techniky je veľmi krátka dĺžka fragmentu, ktorý je schopný spracovať.
Ion Sequencing Torrent
Táto technika je založená na meraní H iónu+ ktorý sa uvoľní zakaždým, keď je inkorporovaný nový nukleotid. Princíp je pomerne podobný pyrosekvenovaniu, ale oveľa lacnejší.
Príklady
Sekvenovanie ľudského genómu
Sekvenovanie genómu človeka je jednou z najsľubnejších výziev v biológii, ako aj jednou z najuznávanejších rivalít v dejinách vedy. V skutočnosti, pre vedcov zapojených do projektu, sekvenovanie genómu sa stalo súťažou.
V roku 1990 začal s projektom "ľudský genóm", vedený slávnym vedcom, nositeľom Nobelovej ceny Jamesom Watsonom. Po roku, v roku 1991, sa Venter vydáva na výzvu "poraziť" Watsona a sekvenovať genóm pred ním. V roku 1992 však Watson odišiel do dôchodku a velenie prevzal ďalší výskumník.
V roku 1995 Venter oznámil svoj úspech v úplnom sekvenovaní bakteriálneho genómu metódou náhodného sekvenovania. Podobne opačný tím o rok neskôr oznámil sekvenovanie genómu kvasiniek.
V roku 2000 sa preteky ukončili. Obe spoločnosti zverejnili svoje predbežné výsledky kompletného genómu v dvoch z najprestížnejších časopisov vo vede: príroda a veda.
Vedci však pokračovali v práci na zlepšovaní návrhov av roku 2006 boli dokončené určité ľudské chromozómy.
Význam a aplikácie
Poznanie poradia nukleotidov molekuly tak dôležité ako DNA je cenné pre biológov a príbuzných odborníkov. Tento reťazec polynukleotidov obsahuje všetky informácie potrebné na vývoj a udržiavanie všetkých foriem života.
Z týchto dôvodov je znalosť tejto sekvencie nevyhnutná pre biologický výskum. Sekvencovanie nám v podstate umožňuje merať jednu z najdôležitejších vlastností biologických systémov a stanoviť rozdiely medzi nimi.
Sekvenovanie je široko používané taxonomistami a systémovými štatistikami, pretože určité sekvencie DNA umožňujú stanoviť kritériá na záver, či dva organizmy patria k tomu istému druhu alebo nie, ako aj schopnosť navrhnúť hypotézy o fylogenetických vzťahoch medzi nimi..
Okrem toho má sekvenovanie DNA aplikácie v oblasti medicíny a diagnostiky. Existujú napríklad cenovo dostupné a prístupné systémy, ktoré nám prostredníctvom sekvencovania umožňujú hodnotiť tendenciu vyvíjať určité ochorenia (napríklad rakovinu) pomocou tzv. Jednoduchých nukleotidových polymorfizmov (SNP)..
Výskumy kriminalistického a forenzného typu boli tiež obohatené o techniky sekvencovania a môžu byť použité ako spoľahlivý dôkaz o účasti určitého jednotlivca na trestnom čine..
referencie
- Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Sekvencia sekvencerov: história sekvenovania DNA. Genomics, 107(1), 1-8.
- Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Ďalšia generácia sekvenčnej revolúcie a jej vplyv na genomiku. bunka, 155(1), 27-38.
- Levy, J. (2010). Vedecké súperenie. Od projektu Galileo po projekt ľudského genómu. Paraninfo Editorial.
- Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). Sekvenovanie DNA s inhibítormi ukončujúcimi reťazec. Zborníky z Národnej akadémie vied, 74(12), 5463-5467.
- Schuster, S.C. (2007). Sekvenovanie nasledujúcej generácie transformuje dnešnú biológiu. Prírodné metódy, 5(1), 16.
- Xu, J. (Ed.). (2014). Sekvenovanie nasledujúcej generácie. Caister Academic Press.