DNA mikročipy v tom, čo sa skladá, postup a aplikácie



DNA microarray, Tiež sa nazýva DNA čip alebo DNA microarray, skladá sa zo série DNA fragmentov ukotvených na fyzickú podporu variabilného materiálu, buď plastu alebo skla. Každý kus DNA predstavuje sekvenciu komplementárnu k špecifickému génu.

Hlavným cieľom mikročipov je porovnávacia štúdia expresie určitých záujmových génov. Napríklad je bežné, že táto technika sa aplikuje na dve vzorky - jednu za zdravých podmienok a jednu patologickú - s cieľom identifikovať, ktoré gény sa exprimujú a ktoré nie sú vo vzorke, ktorá predstavuje stav. Uvedenou vzorkou môže byť bunka alebo tkanivo.

Všeobecne sa expresia génov môže detegovať a kvantifikovať vďaka použitiu fluorescenčných molekúl. Manipulácia s čipmi je vo väčšine prípadov vykonávaná robotom a súčasne môže byť analyzovaný veľký počet génov.

Táto inovatívna technológia je užitočná pre širokú škálu odborov, od lekárskej diagnostiky až po rôzne molekulárno-biologické štúdie v oblasti proteomiky a genomiky..

index

  • 1 Z čoho sa skladá??
    • 1.1 Typy microarray
  • 2 Postup
    • Izolácia RNA RNA
    • 2.2 Produkcia a značenie cDNA
    • 2.3 Hybridizácia
    • 2.4 Systémové čítanie
  • 3 Aplikácie
    • 3.1 Rakovina
    • 3.2 Iné choroby
  • 4 Odkazy

Z čoho sa skladá??

DNA mikročipy (deoxyribonukleová kyselina) sú súborom špecifických segmentov DNA pripojených k pevnej matrici. Tieto sekvencie sú komplementárne k génom, ktoré chcú byť študované a môže byť až 10 000 génov na cm2.

Tieto charakteristiky umožňujú systematické a masívne štúdium génovej expresie organizmu.

Informácie, ktoré bunka potrebuje pre svoju činnosť, sú kódované v jednotkách nazývaných "gény". Niektoré gény obsahujú inštrukcie na vytvorenie základných biologických molekúl nazývaných proteíny.

Gén sa exprimuje, ak je jeho DNA transkribovaná na intermediárnu molekulu mediátorovej RNA a expresia génu sa môže meniť v závislosti od úrovne transkripcie tohto segmentu DNA. V niektorých prípadoch môže zmena expresie naznačovať ochorenia.

Princíp hybridizácie umožňuje fungovanie mikročipov. DNA je molekula zložená zo štyroch typov nukleotidov: adenín, tymín, guanín a cytozín.

Na vytvorenie dvojzávitnicovej štruktúry je adenín spojený s tymínom a cytozínom s guanínom. Teda dva komplementárne reťazce môžu byť spojené vodíkovými väzbami.

Druhy mikročipov

Z hľadiska štruktúry mikročipov existujú dve variácie: personalizované zlúčeniny komplementárnej DNA alebo oligonukleotidov a komerčné mikročipy s vysokou hustotou vyrobené komerčnými spoločnosťami, ako je napríklad Affymetrix GeneChip.

Prvý typ mikročipu umožňuje analýzu RNA z dvoch rôznych vzoriek na jednom čipe, zatiaľ čo druhá variácia je komerčného typu a má veľký počet génov (napríklad Affymetrix GeneChip má približne 12 000 ľudských génov) umožňujúcich analýzu jednu vzorku.

proces

Izolácia RNA

Prvým krokom na vykonanie experimentu s použitím technológie microarray je izolácia a purifikácia molekúl RNA (môže to byť messenger RNA alebo iné typy RNA)..

Ak chcete porovnať dve vzorky (okrem zdravých a chorých, kontrola verzus liečba), mala by sa izolovať molekula v oboch tkanivách..

Produkcia a značenie cDNA

Následne sa RNA podrobí procesu reverznej transkripcie v prítomnosti značených nukleotidov a získa sa tak komplementárna DNA alebo cDNA..

Štítok môže byť fluorescenčný a musí byť diferencovateľný medzi dvoma analyzovanými tkanivami. Tradične sa používajú fluorescenčné zlúčeniny Cy3 a Cy5, pretože emitujú fluorescenciu pri rôznych vlnových dĺžkach. V prípade Cy3 je to farba blízka červenej a Cy5 zodpovedá spektru medzi oranžovou a žltou.

hybridizácia

CDNA sa zmiešajú a inkubácia sa uskutočňuje v DNA mikročipe, aby sa umožnila hybridizácia (t.j. väzba) cDNA z oboch vzoriek s DNA časťou imobilizovanou na pevnom povrchu mikročipu..

Vyššie percento hybridizácie so sondou v mikročipe sa interpretuje ako väčšia tkanivová expresia zodpovedajúcej mRNA.

Systémové čítanie

Kvantifikácia expresie sa uskutočňuje začlenením čítacieho systému, ktorý priradí kód farby množstvu fluorescencie emitovanej každou cDNA. Napríklad, ak sa červená značka používa na označenie patologického stavu a hybridizuje vo väčšom pomere, bude prevládať červená zložka.

S týmto systémom je možné poznať nadmernú expresiu alebo represiu každého analyzovaného génu v oboch vybraných podmienkach. Inými slovami, môžete poznať transkriptóm vzoriek hodnotených v experimente.

aplikácie

V súčasnosti sú mikročipy považované za veľmi silné nástroje v oblasti medicíny. Táto nová technológia umožňuje diagnostiku chorôb a lepšie pochopenie toho, ako je génová expresia modifikovaná za rôznych zdravotných podmienok.

Okrem toho umožňuje porovnanie kontrolného tkaniva a tkaniva liečeného určitým liekom, aby sa študovali účinky možného lekárskeho ošetrenia..

Za týmto účelom sa porovnáva normálny stav a chorý stav pred a po podaní liečiva. Pri štúdiu účinku lieku na genóm in vivo máte lepší prehľad o mechanizme jeho pôsobenia. Okrem toho je možné pochopiť, prečo niektoré konkrétne lieky vedú k nežiaducim vedľajším účinkom.

rakovina

Rakovina vrcholy zoznamov chorôb študovaných s DNA microarrays. Táto metosológia sa používa na klasifikáciu a prognózu ochorenia, najmä v prípadoch leukémie.

Oblasť skúmania tohto stavu zahŕňa kompresiu a charakterizáciu molekulárnych báz rakovinových buniek s cieľom nájsť vzory génovej expresie, ktoré vedú k zlyhaniu regulácie bunkového cyklu a procesov bunkovej smrti (alebo apoptózy)..

Iné ochorenia

Pomocou mikročipov sme boli schopní objasniť profily diferenciálnej expresie génov v zdravotných stavoch alergií, primárnych imunodeficiencií, autoimunitných ochorení (ako je reumatoidná artritída) a infekčných ochorení..

referencie

  1. Bednar, M. (2000). Technológia DNA microarray a aplikácia. Lekársky vedecký monitor, 6(4), MT796-MT800.
  2. Kurella, M., Hsiao, L., Yoshida, T., Randall, J. D., Chow, G., Sarang, S., ... & Gullans, S. R. (2001). DNA microarray analýza komplexných biologických procesov. Journal of American Society of nefrology, 12(5), 1072-1078.
  3. Nguyen, D.V., Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, R. J. (2002). Experimenty s mikročipmi DNA: biologické a technologické aspekty. biometrie, 58(4), 701-717.
  4. Plous, C. V. (2007). DNA mikročipy a ich aplikácie v biomedicínskom výskume. CENIC Magazine. Biologické vedy, 38(2), 132-135.
  5. Wiltgen, M., & Tilz, G. P. (2007). DNA microarray analýza: princípy a klinický dopad. hematológie, 12(4), 271-287.