Základ, príprava a použitie močovinového bujónu

močovinový bujón je kvapalné kultivačné médium, používané na preukázanie prítomnosti enzýmu ureázy v určitých mikroorganizmoch. Ureáza je mikrobiálny enzým, ktorý sa vyrába konštitutívne, to znamená, že sa syntetizuje nezávisle od toho, či je alebo nie je prítomný substrát, na ktorom pôsobí..

Funkcia ureázy súvisí s rozkladom organických zlúčenín. Nie všetky mikroorganizmy sú schopné syntetizovať tento enzým, preto jeho stanovenie v laboratóriu umožňuje identifikovať určité bakteriálne kmene a dokonca rozlišovať medzi druhmi rovnakého rodu..

Existujú dva typy testov močoviny: Stuart a Christensen. Líšia sa svojím zložením a citlivosťou. Prvý je špeciálny na zobrazenie veľkého množstva ureázy produkovanej druhmi rodu Proteus.

Druhá je citlivejšia a môže detegovať malé množstvá ureázy generované neskoro inými bakteriálnymi rodmi, ako je Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter a Mycobacterium.

Stuart urea bujón sa skladá z močoviny, chloridu sodného, ​​fosforečnanu draselného, ​​fosforečnanu draselného, ​​kvasnicového extraktu, fenolovej červene a destilovanej vody..

Zatiaľ čo Christensenova bujón alebo agarová močovina sa skladá z peptonov, chloridu sodného, ​​fosforečnanu monodraselného, ​​glukózy, močoviny, fenolovej červene, destilovanej vody a agaru. Posledne uvedené, iba ak je to pevné médium.

index

• 1 Nadácia
  • 1.1 Stuart urea bujón
  • 1.2 Christensenov bujón alebo agarová močovina
  • 1.3 Interpretácia oboch médií (Stuart a Christensen)
• 2 Príprava
  • 2.1 Stuart urea bujón
  • 2.2 Christensenova živná pôda alebo agarová močovina
• 3 Použitie
• 4 Zasiatie testu močoviny
• 5 Kontrola kvality
• 6 Referencie

nadácie

Enzým ureáza hydrolyzuje močovinu za vzniku oxidu uhličitého, vody a dvoch molekúl amoniaku. Tieto zlúčeniny reagujú za vzniku konečného produktu nazývaného uhličitan amónny.

Stuart močovinový bujón

Močovinový bujón Stuart je pufrovaný s pH 6,8. Preto musí byť mikroorganizmus schopný tvoriť veľké množstvá amoniaku, aby sa zmenil na fenol. PH musí stúpnuť nad 8 ° C.

Preto je močovinový bujón Stuart selektívny pre druhy Proteus, čo dáva pozitívne výsledky v 24 až 48 hodinách inkubácie a nie je účinný pre baktérie, ktoré produkujú malé množstvá ureázy alebo ktoré pomaly hydrolyzujú močovinu..

Je to preto, že druhy Proteus sú schopné používať močovinu ako zdroj dusíka. Na rozdiel od toho, iné baktérie produkujúce ureázu potrebujú ďalší zdroj.

Avšak Pérez et al. (2002) zistili, že Stuartova močovinová živná pôda bola rovnako účinná ako močovinový agar z Christensenu, aby sa určila ureáza v kmeňoch kvasiniek rodov Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon a Saccharomyces..

Autori štúdie tvrdia, že dosiahli 100% koincidenciu s oboma médiami (Stuart a Christensen) inkubáciou počas 24 a 48 hodín; pod podmienkou, že si vzali rovnako pozitívne kmene, ktoré dokázali zmeniť médiá na silnú ružovo-fuchsiovú farbu.

Toto objasnenie je potrebné, pretože Lodder (1970) potvrdil, že takmer všetky kvasinky dokážu umiestniť skosenie močovinového agaru Christensen do svetloružovej farby. Je to preto, že môžu hydrolyzovať močovinu v minimálnych množstvách a vytvárať amíny oxidačnou dekarboxyláciou aminokyselín na povrchu. Toto by sa nemalo interpretovať ako pozitívne.

Bujón alebo močovinový agar z Christensen

Christensen močovinový bujón alebo agar sú menej pufrované a sú schopné detegovať malé množstvá amoniaku. Okrem toho je toto médium obohatené o peptony a glukózu. Tieto zlúčeniny spôsobujú, že sa vyvíjajú ďalšie mikroorganizmy produkujúce ureázu, ktoré nerastú v bujóne Stuart.

Podobne test Christensenovej močoviny ponúka rýchlejší výsledok, najmä pre Proteus, ktorý je schopný poskytnúť veľmi pozitívny výsledok v minimálnom čase 30 minút a maximálne 6 hodín..

Zvyšok mikroorganizmov produkujúcich ureázu po 6 hodinách a mierne po 24, 48, 72 hodinách alebo viac dokáže ľahko zmeniť farbu média a dokonca aj niektoré kmene môžu po 5 alebo 6 dňoch spôsobiť slabé reakcie..

Interpretácia oboch médií (Stuart a Christensen)

Médium má pôvodne žltooranžovú farbu a pozitívna reakcia zmení farbu média na ružovú fuchsiu. Intenzita farby je priamo úmerná množstvu vyrobeného amónia.

Negatívna reakcia zanechá médium pôvodnej farby s výnimkou kvasiniek, ktoré môžu poskytnúť bledoružovú s močovinovým agarom Christensen.

príprava

Stuart močovinový bujón

Odvážte potrebné gramy podľa údajov komerčného domu. Rozpustí sa výhodne vo sterilnej destilovanej vode. Nepoužívajte teplo na rozpustenie, pretože močovina je citlivá na teplo.

Na sterilizáciu sa používa metóda membránovej filtrácie. Na tento účel sa používa filter Millipore s priemerom pórov 0,45 μm. Nepoužívajte autokláv. Po prefiltrovaní sa roztok rozdelí do sterilných skúmaviek. Na získanie spoľahlivých výsledkov sa musí preniesť medzi 1,5 ml a minimálne 3 ml ako maximálne množstvo na skúmavku..

Uchovávajte v chladničke pred použitím.

Ak nie je k dispozícii metóda filtrácie, médium by sa malo okamžite použiť na získanie spoľahlivých výsledkov.

Iný spôsob prípravy bujónu Stuart močoviny je nasledovný:

Niektoré komerčné domy predávajú polovicu základne pre test močoviny, bez močoviny.

Množstvo uvedené obchodným domom sa zváži. Rozpustí sa v destilovanej vode a sterilizuje sa v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút. Nechajte ho trochu oddychovať a keď je médium teplé, pridajte 100 ml roztoku močoviny pripraveného pri 20% a sterilizujte filtráciou.

Je distribuovaný v sterilných skúmavkách, ako bolo opísané vyššie.

Bujón alebo močovinový agar z Christensen

-Príprava roztoku močoviny

Navážte 29 g dehydratovanej močoviny a rozpustite v 100 ml destilovanej vody. Na sterilizáciu použite metódu filtrácie. Nepoužívajte v autokláve.

-Agar na báze močoviny

24 g dehydratovaného bázového agaru sa rozpustí v 950 ml destilovanej vody. Sterilizujte v autokláve pri 121 ° C počas 15 minút. Nechajte stáť, kým nedosiahne teplotu 50 ° C a pridajte vopred pripravenú močovinu asepticky.

Nalejte 4 až 5 ml do sterilných skúmaviek a nakloňte až do stuhnutia. Mal by tu byť dlhý píšťalkový vrchol.

Toto médium môže byť tiež pripravené v kvapalnej forme.

aplikácie

Test močoviny je mimoriadne účinný pri rozlišovaní rodu Proteus od iných rodov čeľade Enterobacteriaceae, vzhľadom na rýchlu reakciu poskytnutú Proteusom..

Ak sa používa zloženie Christensenu, test pomáha rozlišovať medzi druhmi rovnakého rodu. Napríklad, S. haemolyticus a S. warneri sna Staphylococcus koaguláza negatívna a betahemolytická, líšia sa v tom S. haemolyticus je to negatívna močovina a S. warneri je to pozitívna močovina.

Na druhej strane, McNulty úspešne použil 2% Christensen močovinový vývar na štúdium prítomnosti Helicobacter pylori vo vzorkách biopsií odobratých z žalúdočnej sliznice (antrálnej oblasti).

Prítomnosť H. pylori Dôkazom je pozitívny test močoviny. Trvanie pozorovania výsledkov je priamo úmerné množstvu prítomných mikroorganizmov.

Ako je možné vidieť, ide o jednoduchý spôsob diagnostiky Helicobacter pylori v biopsii žalúdka.

Tento test je tiež užitočný na rozlíšenie druhov rodov Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus a Mycobacteria.

Zasiatie močovinového testu

Tieto dva spôsoby vyžadujú silné mikrobiálne inokulum na optimalizáciu výsledkov. Bakteriálne kolónie sa výhodne odoberajú z krvných agarových a Sabouraudových agarových kvasiniek s určitými výnimkami. Inokulum sa emulguje v kvapalnom médiu.

Pre Stuartovu močovinovú živnú pôdu inkubovanú pri 37 ° C počas 24 až 48 hodín, s vedomím, že sa hľadá len kmene rodu Proteus, keď kmeň je baktéria. V prípade kvasiniek sa môže inkubovať pri teplote 37 ° C alebo pri teplote miestnosti počas 24 až 48 hodín inkubácie.

V prípade močovinového bujónu Christensen inkubujte 24 hodín pri 37 ° C. Ak je test negatívny, môže sa inkubovať až 6 dní. Ak je test pozitívny pred 6 hodinami, znamená to, že ide o kmeň rodu Proteus.

V prípade močovinového agaru Christensen je šikmý agar silne inokulovaný bez prepichnutia. Bujón sa inkubuje a interpretuje rovnakým spôsobom.

Kontrola kvality

Kontrolné kmene sa môžu použiť na testovanie média, ako je napr Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 a Salmonella typhimurium.  Prvé dve musia priniesť pozitívne výsledky a posledné dva negatívne výsledky.

referencie

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Použitie Stuart močovinového bujónu na ureázový test ako test na diagnostiku kvasiniek. Soc. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. K dispozícii na: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy na identifikáciu klinicky významných baktérií. 3. vydanie. Redakčná Panamericana. Buenos Aires Argentína.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologická diagnostika Bailey & Scott. 12 ed. Redakcia Panamericana S.A. Argentína.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. vydanie. Redakcia Panamericana S.A. Argentína.
5. Laboratories Britania. Christensen Medio (Urea agar base) 2015. K dispozícii na: britanialab.com