Vlastnosti a príprava bakteriálneho steru



 bakteriálny náter je rozšírenie vo forme tenkej vrstvy suspenzie bakteriálnych mikroorganizmov, ktorá sa uskutočňuje na priehľadnej sklenenej doske alebo sklíčkach, na pozorovanie pod optickým mikroskopom.

Rozšírenie vo forme filmu sa vykonáva tak, aby sa mikroorganizmy čo najviac oddelili, pretože ak sú zoskupené, pozorovanie nie je jasné..

V štúdii techniky bakteriálnych kultúr sa používajú metódy prípravy sterov, fixácie a sfarbenia na ich lepšiu analýzu. Kvôli malej veľkosti mikroorganizmov sa na jeho pozorovanie nevyhnutne vyžaduje použitie optického mikroskopu.

Optické mikroskopy sú nepostrádateľnými nástrojmi na pozorovanie škvŕn. Používajú optické šošovky a svetlo umožňujúce vizualizáciu vzoriek s veľkým zväčšením veľkosti.

Vo všeobecnosti, živé bunky nemajú štruktúry, ktoré sú väčšinou farebné, videné optickým mikroskopom sú bezfarebné, transparentné vzorky a vykazujú veľmi malý vnútorný kontrast a ich okolie.

Pozorovanie pomocou mikroskopu jednoduchého svetelného poľa, bez použitia pomocných techník farbenia, je veľmi obmedzené a používa sa len v niektorých prípadoch, ako pri pozorovaní pohybu mikroorganizmov..

Na optimálne pozorovanie mikroorganizmov sa musí dosiahnuť rovnováha medzi kontrastom a rozlíšením. Podrobnosti o bunkách nemožno pozorovať pod mikroskopom, dokonca ani pri vysokom rozlíšení; použitie farbív sa vyžaduje technikami farbenia, ktoré poskytujú kontrast pre pozorovanie.

index

  • 1 Charakteristika kvalitného bakteriálneho náteru
    • 1.1 Vynikajúci kontrast
    • 1.2 Dobrá fixácia
    • 1.3 Dobré farbenie
  • 2 Príprava
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Fixácia
    • 2.3 C. Jednoduché farbenie
    • 2.4 D. Konečné uchovanie steru
  • 3 Odkazy

Charakteristika kvalitného bakteriálneho náteru

Vynikajúci kontrast

Na dosiahnutie vynikajúceho kontrastu sa nazývajú sofistikované mikroskopy fázový kontrastný mikroskop, diferenciálna interferencia a mikroskop s tmavým poľom. Tento typ mikroskopu sa okrem iného používa na pozorovanie bakteriálnych štruktúr, ako sú plášte a vlákna.

Farbenie je jednoduchá technika na zvýšenie kontrastu, ktorá sa dosahuje mikroskopom s čistým poľom. Pri tejto technike sa môžu použiť rôzne farbivá, ktoré výrazne zlepšujú pozorovanie pod mikroskopom.

Škvrny sa urobia priamo na šmouhách alebo rozšíreniach suspenzií mikroorganizmov na sklíčkach, vopred vysušených a fixovaných..

Dobrá fixácia

Fixácia je technika, ktorá sa používa na zachovanie bunkových štruktúr; spôsobuje inaktiváciu mikroorganizmov a adhéziu k sklu sklíčka. Existujú rôzne spôsoby fixácie: tepelná fixácia a chemická fixácia.

Tepelná fixácia

Toto je metóda, ktorá sa najviac využíva pri pozorovaní bakteriálneho steru. Technika spočíva v prechode bakteriálnej suspenzie šmuhy plameňom zapaľovača. Táto technika je schopná zachovať vonkajšiu morfológiu baktérií, ale ničí ich vnútorné štruktúry.

Chemická fixácia

Chemická fixácia využíva okrem iných chemikálie na konzerváciu, ako je formaldehyd alebo formaldehyd, etanol a kyselina octová. Výhodou použitia chemických fixačných činidiel je, že sa dosiahne zachovanie vnútorných bunkových štruktúr mikroorganizmov.

Dobré farbenie

Najbežnejšie postupy na farbenie predtým vysušeného a fixného rozkladu sú pozitívne alebo jednoduché farbenie, diferenciálne farbenie a negatívne farbenie. Existujú aj špeciálne techniky na farbenie jednotlivých bunkových štruktúr (kapsula, spór, bičík)..

Pozitívne farbenie alebo jednoduché farbenie

Pozitívne alebo jednoduché farbenie je najpoužívanejšia technika farbenia škvŕn. Používa farbivá, ktoré majú schopnosť viazať sa na určité mikrobiálne štruktúry, čo im umožňuje pozorovať ich pod mikroskopom.

Tieto farbivá majú chromoforické skupiny (farebná časť) v ich chemickej štruktúre, so striedajúcimi sa dvojitými väzbami a jednoduchými väzbami (konjugácia). Tieto väzby môžu následne vytvoriť iónové alebo kovalentné väzby s niektorými bunkovými štruktúrami.

Farbivá použité v pozitívnom alebo jednoduchom farbení sú väčšinou chemické deriváty anilín (farebné organické soli).

Na druhej strane medzi farbivami nájdeme niektoré so základným pH a iné s kyselinovým pH.

Základné farbivá

V základných farbivách má chromoforová skupina pozitívny elektrický náboj. Prevažná väčšina prokaryotických mikroorganizmov má neutrálne vnútorné pH a ich bunkový povrch je negatívne nabitý. Prostredníctvom tejto elektrostatickej interakcie sa chromofor viaže na bunku a farbí ju.

Príkladmi základných farbív sú metylénová modrá, fialový kryštál, malachitová zelená, bázický fuscín, safranín, medzi inými..

Kyslé farbivá

V kyselinových farbivách má chromoforová skupina negatívny elektrický náboj. Tieto sa používajú na farbenie proteínov s pozitívne nabitými aminoskupinami. Príkladmi kyslých farbív sú kyselina fuscín, ružová bengálska, konžská červená a eozín.

Diferenciálne farbenie

Technika diferenciálneho farbenia spočíva v použití dvoch farbív rôznej farby alebo intenzity na rozlíšenie rôznych mikroorganizmov pod mikroskopom. Farbenie podľa Grama a rezistencia voči kyselinám a alkoholom sú najčastejšie používanými diferenciálnymi farbivami v bakteriológii.

Gram farbenie sa používa ako predbežný test na poznanie tvaru, veľkosti, zoskupenia buniek, okrem typu bunkovej steny. Pomocou Gramovho testu sa baktérie s bunkovou stenou klasifikujú ako grampozitívne baktérie a gramnegatívne baktérie.

Negatívne farbenie

V tejto technike sa používajú chemické farbivá, ktoré neprenikajú do bunkového vnútra, ale robia to, že médium, v ktorom sa mikroorganizmy objavujú ako čierne pozadie.

V technike negatívneho farbenia sa šmouha vyrába kvapkou suspenzie čínskeho atramentu alebo nigrozínu, ktorý po povolení sušenia pri teplote miestnosti vytvára film nepriehľadný pre priechod svetla. Týmto spôsobom sa mikroorganizmy pozorujú ako svetlé formy na tmavom pozadí.

príprava

A. Rozmazanie

1.- Sklíčka dobre umyte, osušte nasiaknutým papierom a označte ich. Na etikete musí byť uvedený obsah prípravku, dátum a meno osoby, ktorá ho spracovala.

2.- Zapaľovač zapaľovača a očkovaciu slučku v plameni sterilizujte tak, aby bola červená.

3.- Nechajte rukoväť vychladnúť.

4.- Vezmite skúmavku bakteriálnej kultúry, odstráňte uzáver a rýchlo prejdite cez ústie skúmavky v blízkosti plameňa zapaľovača (plameň)..

5. - Injekčnú slučku vložte do skúmavky obsahujúcej bakteriálnu kultúru a odoberte vzorku.

6.- Ak je kultúra v kvapalnom médiu, odoberte vzorku odobratú rukoväťou v strede sklíčka a opatrne ju rozprestrite do kruhu s priemerom približne 2 cm..

7.- Opäť sterilizujte očkovaciu slučku.

8.- Nechajte uschnúť náter vo vzduchu.

9.- Opakujte kroky 3 až 8 trikrát.

10.- Ak je kultúra v pevnom médiu, kvapka destilovanej vody by sa mala umiestniť na sklíčko. Toto sa uskutoční tak, že sa zmieša malá vzorka kultúry odobratej s rukoväťou inokulácie podľa indikácií krokov 2 až 5 (stavy asepsy)..

11.- Roztiahnutú vzorku natiahnite kvapkou vody na sklíčko a opakujte trikrát.

B. Fixácia

1.- K suchým náterom - z kultúr v kvapalnom médiu - sa pridajú dve kvapky metanolu alebo absolútneho etanolu.

2.- Nechajte sušenie vo vzduchu od zapaľovača.

3.- Ak škvrna pochádza z kultúry v pevnom médiu, suchý náter sa fixuje teplom, 2 až 3 krát rýchlo prechádza cez najhorúcejšiu oblasť plameňa zapaľovača..

4.- Dotknite sa spodnej časti šmuhy chrbtovou časťou ľavej ruky (pre pravákov, inak použite pravú ruku) a skontrolujte, či je studená..

C. Jednoduché farbenie

1.- Pridajte 2 kvapky vybraného farbiva do náteru a nechajte pôsobiť po dobu potrebnú v špecifických protokoloch každého farbiva (zvyčajne medzi 1 a 5 minútami)..

2.- Niektoré farbivá vyžadujú na ich aktiváciu použitie tepla, v takom prípade je potrebné byť veľmi opatrný pri zohrievaní sklíčka v plameni zapaľovača (manipulujte s ním pinzetou a vyvarujte sa varu). Prehriatie náteru môže zničiť bunky, ktoré chcete pozorovať.

3.- Prebytočné farbivo odstráňte premytím destilovanou vodou z picette. Odstráňte čistiacu vodu jemným poklepaním na podložku na jej okraji, nakloneným na pracovnom stole.

4.- Nechajte sušenie vzduchu.

5.- V závislosti od typu pozorovania sa v tomto štádiu používa alebo nepoužíva krycie sklíčko. Krycie sklíčko chráni a zachováva šmuhy. Ak sa v tomto štádiu urobí pozorovanie ponorením do oleja, nepoužije sa žiadne krycie sklíčko, ale rozmazanie sa nedá zachovať.

D. Konečné uchovanie náteru

1.- Postupne ponorte náter do každého z nižšie uvedených roztokov, minimálne počas 5 minút. Účelom týchto "kúpeľov" je nechať náter úplne dehydratovaný. Každé činidlo musí byť vypustené pred zavedením náteru v nasledujúcom kúpeli.

Poradie dehydratačných kúpeľov je nasledovné:

  1. 70% etanol
  2. 95% etanol
  3. Čistý acetón
  4. Zmes acetón-xylol 1: 1
  5. xylén

Potom nechajte sušenie na vzduchu.

2. Namontujte krycie sklíčko, výhodne 22 × 22 mm, s použitím kanadského balzamu alebo iných prostriedkov montáže.

referencie

  1. Briggs, G. (1965). Príčinné faktory v mikrobiologických laboratórnych nehodách a infekciách. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
  2. Cappucino, J.G. a Welch, C.T. (2017). Mikrobiológia: Laboratórny manuál. Pearson.
  3. Holt, J.G. Editor. (1977). Kratší Bergeyho manuál determinatívnej bakteriológie. 8th Baltimore: The Williams a Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. a Prípad; C. L. (2018). Laboratórne experimenty v mikrobiológii. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Diagnostická mikrobiológia. 14th Louis, USA: Elsiever, Inc..