Funkcie reštrikčných enzýmov, mechanizmus účinku, typy a príklady



reštrikčné enzýmy sú to endonukleázy používané určitými archaeami a baktériami na inhibíciu alebo "obmedzenie" šírenia vírusov v nich. Sú obzvlášť časté v baktériách a sú súčasťou ich obranného systému proti cudzej DNA známej ako systém reštrikcie / modifikácie.

Tieto enzýmy katalyzujú rezanie dvojvláknovej DNA v špecifických miestach, reprodukovateľne a bez použitia dodatočnej energie. Väčšina si vyžaduje prítomnosť kofaktorov, ako sú horčík alebo iné dvojmocné katióny, hoci niektoré tiež vyžadujú ATP alebo S-adenozylmetionín.

Restrikčné endonukleázy boli objavené v roku 1978 Danielom Nathansom, Arberom Wernerom a Hamiltonom Smithom, ktorí dostali Nobelovu cenu za medicínu za ich objav. Jeho názov sa zvyčajne odvodzuje od organizmu, kde sa prvýkrát pozoruje.

Takéto enzýmy sa široko používajú pri vývoji metód klonovania DNA a iných stratégií molekulárnej biológie a genetického inžinierstva. Jeho charakteristiky rozpoznávania špecifických sekvencií a schopnosť rezať sekvencie v blízkosti rozpoznávacích miest z nich robia silné nástroje v genetickom experimentovaní.

Fragmenty vytvorené reštrikčnými enzýmami, ktoré pôsobili na určitú molekulu DNA, sa môžu použiť na vytvorenie "mapy" pôvodnej molekuly s použitím informácií o miestach, kde enzým rozštiepi DNA..

Niektoré reštrikčné enzýmy môžu mať rovnaké rozpoznávacie miesto v DNA, ale nemusia ho nevyhnutne strihať rovnakým spôsobom. Existujú teda enzýmy, ktoré robia rezy, ktoré zanechávajú tupé konce, a enzýmy, ktoré rezajú, čím zanechávajú kohézne konce, ktoré majú rôzne uplatnenie v molekulárnej biológii..

V súčasnosti existujú stovky rôznych komerčne dostupných reštrikčných enzýmov, ktoré ponúkajú rôzne komerčné domy; tieto enzýmy fungujú ako „vlastné“ molekulárne nožnice na rôzne účely.

index

  • 1 Funkcie
  • 2 Mechanizmus pôsobenia
  • 3 Typy
    • 3.1 Reštrikčné enzýmy typu I
    • 3.2 restrikčné enzýmy typu II
    • 3.3 restrikčné enzýmy typu III
    • 3.4 Reštrikčné enzýmy typu IV
    • 3.5 restrikčné enzýmy typu V
  • 4 Príklady
  • 5 Referencie

funkcie

Reštrikčné enzýmy slúžia opačnej funkcii polymeráz, pretože hydrolyzujú alebo rozkladajú esterovú väzbu vo fosfodiesterovej väzbe medzi susednými nukleotidmi v nukleotidovom reťazci.

V molekulárnej biológii a genetickom inžinierstve sú široko používané nástroje na konštrukciu expresných a klonovacích vektorov, ako aj na identifikáciu špecifických sekvencií. Sú tiež užitočné na konštrukciu rekombinantných genómov a majú veľký biotechnologický potenciál.

Nedávne pokroky v génovej terapii v súčasnosti využívajú reštrikčné enzýmy na zavedenie určitých génov do vektorov, ktoré sú nositeľmi transportu takýchto génov do živých buniek, a ktoré majú pravdepodobne schopnosť byť vložené do bunkového genómu na uskutočnenie trvalé zmeny.

Mechanizmus účinku

Reštrikčné enzýmy môžu katalyzovať rezanie dvojvláknovej DNA, hoci niektoré sú schopné rozpoznávať jednovláknové DNA sekvencie a dokonca aj RNA. Rez sa vykoná po rozpoznaní sekvencií.

Mechanizmus účinku spočíva v hydrolýze fosfodiesterovej väzby medzi fosfátovou skupinou a deoxyribózou v hlavnom reťazci každého reťazca DNA. Mnohé enzýmy sú schopné rezať na rovnakom mieste, ktoré rozpoznajú, zatiaľ čo iné odrezávajú medzi 5 a 9 pármi báz pred alebo po ňom..

Normálne sa tieto enzýmy štiepia na 5 'konci fosfátovej skupiny, čím vznikajú fragmenty DNA s 5' fosforylovým koncom a koncovým 3 'hydroxylovým koncom..

Pretože proteíny neprichádzajú do priameho kontaktu s rozpoznávacím miestom v DNA, musia byť translokované postupne, až kým nedosiahnu špecifické miesto, napríklad pomocou "posuvných" mechanizmov na DNA vlákne..

Počas enzymatického rezu je fosfodiesterová väzba každého reťazca DNA umiestnená v jednom z aktívnych miest reštrikčných enzýmov. Keď enzým opustí miesto rozpoznávania a rezania, robí to prostredníctvom nešpecifických prechodných asociácií.

typ

V súčasnosti je známych päť typov restrikčných enzýmov. Nižšie uvádzame stručný popis každého z nich:

Reštrikčné enzýmy typu I

Tieto enzýmy sú veľké pentamérne proteíny s tromi podjednotkami, reštrikciou, metyláciou a inou pre rozpoznávanie sekvencií v DNA. Tieto endonukleázy sú multifunkčné proteíny schopné katalyzovať reštrikčné a modifikačné reakcie, majú ATPázovú aktivitu a tiež DNA topoizomerázu..

Enzýmy tohto typu boli prvými endonukleázami, ktoré sa mali objaviť, prvýkrát sa purifikovali v šesťdesiatych rokoch a odvtedy sa študovali s veľkou hĺbkou.

Enzýmy typu I nie sú široko používané ako biotechnologický nástroj, pretože miesto rezu môže byť v variabilnej vzdialenosti až 1000 párov báz z miesta rozpoznávania, čo z nich robí nespoľahlivé z hľadiska experimentálnej reprodukovateľnosti..

Restrikčné enzýmy typu II

Sú to enzýmy zložené z homodimérov alebo tetramérov, ktoré delia DNA na definovaných miestach v dĺžke 4 až 8 bp. Tieto miesta rezania sú typicky palindromické, to znamená, že rozpoznávajú sekvencie, ktoré sa čítajú rovnakým spôsobom v oboch smeroch.

Mnohé restrikčné enzýmy typu II v baktériách rezajú DNA, keď rozpoznajú svoj cudzí charakter, pretože nemajú typické modifikácie, ktoré by mala mať vlastná DNA..

Toto sú najjednoduchšie reštrikčné enzýmy, pretože nevyžadujú žiadny kofaktor iný ako horčík (Mg +) na rozpoznanie a rezanie sekvencií DNA.

Presnosť reštrikčných enzýmov typu II pri rozpoznávaní a rezaní jednoduchých sekvencií v DNA v presných pozíciách z nich robí jeden z najviac používaných a nepostrádateľných vo väčšine odvetví molekulárnej biológie..

V rámci skupiny restrikčných enzýmov typu II sú viaceré podtriedy klasifikované podľa určitých vlastností, ktoré sú pre každú z nich jedinečné. Klasifikácia týchto enzýmov sa vykonáva pridaním písmen abecedy od A do Z podľa názvu enzýmu.

Niektoré z najznámejších podtried pre ich užitočnosť sú:

Podtrieda IIA

Sú to diméry rôznych podjednotiek. Rozpoznávajú asymetrické sekvencie a používajú sa ako ideálne prekurzory na generovanie rezných enzýmov.

Podtrieda IIB

Skladajú sa z jedného ďalšieho diméru a rezu DNA na obidvoch stranách rozpoznávacej sekvencie. Rezali obidve vlákna DNA v rozsahu párov báz mimo rozpoznávacie miesto.

Podtrieda IIC

Enzýmy tohto typu sú polypeptidy s funkciou delenia a modifikácie reťazcov DNA. Tieto enzýmy štiepia obidve vlákna asymetricky.

Podtrieda IIE

Enzýmy tejto podtriedy sú najviac používané v genetickom inžinierstve. Majú katalytické miesto a všeobecne vyžadujú alosterický efektor. Tieto enzýmy musia komunikovať s dvoma kópiami ich rozpoznávacích sekvencií, aby sa dosiahol účinný rez. V tejto podtriede sú enzýmy EcoRII a EcoRI.

Restrikčné enzýmy typu III

Reštrikčné endonukleázy typu III sa skladajú len z dvoch podjednotiek, z ktorých jeden je zodpovedný za rozpoznávanie a modifikáciu DNA, zatiaľ čo druhý zodpovedá za rezanie sekvencie..

Tieto enzýmy vyžadujú pre svoje fungovanie dva kofaktory: ATP a horčík. Reštrikčné enzýmy tohto typu majú dve asymetrické rozpoznávacie miesta, translokujú DNA spôsobom závislým od ATP a odrežú ju medzi 20 až 30 bp v blízkosti rozpoznávacieho miesta..

Restrikčné enzýmy typu IV

Enzýmy typu IV sa ľahko identifikujú, pretože rezajú DNA metylačnými tagmi, sú tvorené niekoľkými rôznymi podjednotkami, ktoré sú zodpovedné za rozpoznávanie a delenie DNA sekvencie. Tieto enzýmy používajú ako kofaktory GTP a dvojmocný horčík.

Špecifické miesta pre rezanie zahŕňajú nukleotidové reťazce so zvyškami metylovaného alebo hydroxymetylovaného cytozínu v jednom alebo obidvoch reťazcoch nukleových kyselín.

Reštrikčné enzýmy typu V

Táto klasifikácia zoskupuje enzýmy typu CRISPER-Cas, ktoré identifikujú a štiepia špecifické sekvencie DNA z invazívnych organizmov. Enzýmy Cas využívajú na rozpoznávanie a napadnutie inváznych organizmov reťazec CRISPER syntetizovanej vodiacej RNA.

Enzýmy klasifikované ako typ V sú polypeptidy štruktúrované enzýmami typu I, II a II. Môžu rezať úseky DNA takmer akéhokoľvek organizmu as veľkým rozsahom dĺžky. Ich flexibilita a jednoduchosť použitia robia tieto enzýmy jedným z najčastejšie používaných nástrojov v genetickom inžinierstve dnes spolu s enzýmami typu II.

Príklady

Reštrikčné enzýmy sa používajú na detekciu polymorfizmov DNA, najmä v štúdiách populačnej genetiky a evolučných štúdií s použitím mitochondriálnej DNA, aby sa získali informácie o rýchlostiach substitúcií nukleotidov..

V súčasnosti vektory používané na transformáciu baktérií s rôznym účelom majú multiclonache miesta, kde sa nachádzajú rozpoznávacie miesta pre viaceré reštrikčné enzýmy..

Medzi týmito enzýmami sú najobľúbenejšie EcoRI, II, III, IV a V, získané a opísané po prvýkrát E. coli; HindIII, od H. influenzae a BamHI B. amyloliquefaciens.

referencie

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). Biológia obmedzenia DNA. Mikrobiologické recenzie, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Poskytuje získanú rezistenciu voči vírusom v prokaryotoch. veda, 315(Marec), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Molekulárna perspektíva: restrikčné endonukleázy. Kmeňové bunky Základy rakoviny, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Preskakovanie, skákanie a slučkovanie reštrikčnými enzýmami. Transakcie s biochemickou spoločnosťou, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Udržiavanie druhovej identity a kontrola speciacií baktérií: nová funkcia pre systémy obmedzovania / modifikácie? gen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewinove gény XII (12 vyd.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Ona, Q. (2015). Využitie systémov CRISPR-Cas typu I a typu III na úpravu genómu. Výskum nukleových kyselín, 1-12.
  8. Loenen, W. A. ​​M., Dryden, D. T., Raleigh, E.A., & Wilson, G. G. (2013). Reštrikčné enzýmy typu I a ich príbuzní. Výskum nukleových kyselín, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Reštrikcia Endonukleázy pri analýze a reštrukturalizácii molekúl DNA. Annu. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). Dna polymorfizmus detegovateľný reštrikčnými endonukleázami. genetika, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Reštrikčné endonukleázy typu II a molekulárne biologické vedy: štruktúra a mechanizmus. CMLS Bunkové a molekulárne biologické vedy, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Ako sa reštrikčné enzýmy stali pracovníkmi molekulárnej biológie. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R.J., & Murray, K. (1976). Reštrikčné endonukleázy. Kritické recenzie v biochémii, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B.L. (2005). Štruktúra a funkcia homing endonukleázy. Štvrťročné recenzie biofyziky, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Biológia obmedzenia a anti-obmedzenia. Aktuálne stanovisko v mikrobiológii, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G.G., & Murray, N.E. (1991). Systémy obmedzenia a modifikácie. Annu. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Genomické pohľady na virulenciu Campylobacter jejuni a populačnú genetiku. Nakaziť. Dis. Transl. med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Štruktúra a mechanizmus multifunkčných reštrikčných endonukleáz. Annu. Biochem., 50, 285-315.